本发明专利技术公开一种高产2‑苯乙醇的酵母工程菌及其制备方法与应用，该工程菌的构建方法如下：在酵母菌中共表达参与编码Aro9和Aro10基因表达的激活因子Aro80以及谷氨酸脱氢酶（GdhA），获得产2‑苯乙醇的酵母重组菌，实现了“自给自足”的辅因子循环，提高了2‑苯乙醇的产率。本发明专利技术在此基础上还对发酵工艺进行优化，进一步提高了2‑苯乙醇的转化率，对今后2‑苯乙醇的生产工艺具有重要应用价值。
A yeast engineering strain with high yield of 2-phenylethanol and its preparation method and Application
The invention discloses a yeast engineering strain with high yield of 2 phenylethanol and its preparation method and application. The construction method of the engineering strain is as follows: co-expression of activator Aro80 and glutamate dehydrogenase (GdhA) involved in gene expression of Aro9 and Aro10 in yeast, obtaining yeast recombinant strain producing 2 phenylethanol, realizing the cofactor cycle of \self-sufficiency\ and improving 2 benzene. The yield of ethanol. On this basis, the fermentation process is optimized, and the conversion rate of 2 phenylethanol is further improved, which has important application value for the production process of 2 phenylethanol in the future.
【技术实现步骤摘要】
一种高产2-苯乙醇的酵母工程菌及其制备方法与应用
本专利技术属于基因工程领域，尤其是涉及一种高产2-苯乙醇的酵母工程菌及其制备方法与应用。
技术介绍
2-苯乙醇(2-Phenylethylalcohol，2-PE)是一种具有玫瑰花香的芳香醇，常温下是一种无色粘稠液体，天然存在于许多花和植物精油中，如玫瑰、风信子、茉莉、百合等。2-苯乙醇所具有的玫瑰芳香颇受人们欢迎，也因此被广泛应用于食品、化妆品、日用品等行业，它不仅是所有玫瑰型香气的基本组分，而且还因具有协合增效作用而成为多种香型配方所必须的组分。作为香料添加剂，可用于玫瑰、焦糖、蜂蜜及其他果香型食品香精及各种烟用香精、皂用香精的配制，其使用量仅次于香兰素，是世界第二大香料成分。目前，2-苯乙醇主要通过化学方式生产，但化学合成的风味化合物在某些领域的应用受到限制，特别是在食品工业中，天然风味化合物显然更受消费者的青睐。然而，从花卉和植物的精油中提取天然的2-苯乙醇是昂贵且低效的，市场价格高达1，000美元/kg。从上世纪末开始，随着人们对生活品质要求的提高和对健康的关注，消费者越来越注重食品、日用品等的安全性，“绿色”、“天然”、“健康”的理念不断加强，使得食品、日用品等行业也越来越倾向于使用天然的添加剂。在美国和欧洲，都有相关规定认为，采用物理方法从天然材料中提取和酶催化或微生物发酵法生产的调味剂或芳香剂可以被标记为“天然”。需求量之大以及生产成本之高，使得从玫瑰或其他精油中提取的天然2-苯乙醇远远不能满足市场的需要。而利用微生物发酵法生产2-苯乙醇就成为了一种极具吸引力的选择，具有产品绿色天然、成本低、周期短、反应条件温和、环境污染小等突出优点，是2-苯乙醇制备研究的主流方向，具有良好的发展前景。一些微生物本身就具有合成2-苯乙醇的能力，为微生物发酵法生产2-苯乙醇奠定了基础。酿酒酵母具有较高的2-苯乙醇合成能力，同时对多种环境胁迫具有很好的适应性，是微生物发酵法生产2-苯乙醇的理想菌种。酵母菌株通过Ehrlich途径生产2-苯乙醇由三个步骤组成：L-苯丙氨酸转氨生成L-苯丙酮酸，L-苯丙酮酸脱羧生成苯乙醛，最后苯乙醛还原成2-苯乙醇。但是目前我国使用酵母发酵法生产2-苯乙醇的技术还不算成熟，产量停留在一个较低水平。已有研究主要集中在菌种的自然筛选、传统的微生物育种或发酵工艺的改进上，存在着2-苯乙醇合成能力有限，难以进行大规模工业化生产的问题。目前有关于生物生产2-苯乙醇的专利里，提出了3株可用于2-苯乙醇生产的发酵菌株，分别是于2013年8月27日申请的专利里，提出的酿酒酵母WHH6菌株，于2010年12月20日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(申请号为201210309144.6)。和2014年12月8日申请的专利里，也有一株2-苯乙醇产量最高3.39g/L酿酒酵母菌株(申请编号为201410743753.1)。以及在2016年4月22日的专利里，有选取高渗透压的产甘油假丝酵母转化L-苯丙氨酸发酵生产2-苯乙醇(申请编号201610256845.6)该菌株可利用7g/L的L-苯丙氨酸生成5g/L的苯乙醇。但总体而言2-苯乙醇的产量仍受菌株耐受以及底物抑制的限制，产量始终保持在较低水平，无法满足广大的市场需求。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供一种高产2-苯乙醇的酵母工程菌及其制备方法与应用，目的是针对目前市场对天然绿色产品的需要，以及生物法生产2-苯乙醇产物产量低的问题，通过构建转录激活因子(Aro80)和谷氨酸脱氢酶(GdhA)重组质粒，并将其转入酿酒酵母中，使该工程菌串联表达Aro80和GdhA。在酿酒酵母中，L-苯丙氨酸通过氨基酸转氨酶(Aro90)的作用生成苯丙酮酸，再通过丙酮酸脱羧酶(Aro10)的作用生成苯乙醛，苯乙醛经过脱氢酶(ADH1)氧化脱氢生成苯乙醇。其中，Aro80的过表达会以更高水平激活氨基酸转氨酶(Aro9)和丙酮酸脱羧酶(Aro10)的表达，从而提高苯乙醇的产量如图1所示。而通过引入GdhA的表达，可将L-谷氨酸分解为α-酮戊二酸和NAD(P)H，为转化过程提供了氨基受体和还原力，可实现辅因子和还原力的再生和平衡，从而提高苯乙醇的产量，如图2所示。两者的串联表达可使2-苯乙醇的产量得到较大的提升；另外，本专利技术还通过在酵母的发酵工艺中添加L-谷氨酸、α-酮戊二酸、沸石，以此增加转化体系中的反应物物质浓度以及消除循环过程合成的NH3，以提高2-苯乙醇的合成效率。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种高产2-苯乙醇的酵母工程菌的制备方法，向受体酿酒酵母中导入转录激活因子Aro80基因和谷氨酸脱氢酶GdhA基因，得到高产2-苯乙醇的酿酒酵母工程菌。进一步的，所述转录激活因子Aro80是如下a)或b)的蛋白质：a)SEQIDNo.1所示的蛋白质；b)将SEQIDNo.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。进一步的，所述谷氨酸脱氢酶GdhA是如下a)或b)的蛋白质：a)SEQIDNo.2所示的蛋白质；b)将SEQIDNo.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。进一步的，所述受体酿酒酵母为酿酒酵母YS58。本专利技术还保护一种上述方法得到的产2-苯乙醇的酿酒酵母工程菌。本专利技术还保护一种一种制备2-苯乙醇的的方法，将上述酿酒酵母工程菌进行发酵培养，得到进一步的，制备2-苯乙醇的的方法包括如下具体步骤：(1)种子液制备：将上述酿酒酵母工程菌接种入YEPD培养基中，28-32℃活化12h；(2)发酵液制备：接种步骤(1)制备的种子液于发酵培养基中，接种量10％，28-32℃、220r/min培养36h，得到发酵液；(3)将步骤(2)制备的发酵液，12000rpm离心10min，取上清液，弃菌体，上清液经0.22μm滤膜过滤后，得到2-苯乙醇；所述发酵培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为L-苯丙氨酸、葡萄糖、硫酸镁和磷酸二氢钾；所述L-苯丙氨酸在发酵培养基中的浓度为5g/L，所述葡萄糖在发酵培养基中的浓度为20g/L，所述硫酸镁在发酵培养基中的浓度为0.5g/L，所述磷酸二氢钾在发酵培养基中的浓度为0.5g/L。进一步的，所述发酵培养基的溶质还包括0.736g/L-2.944g/L的L-谷氨酸、0g/L-3.497g/Lα-酮戊二酸和0g/L-20g/L沸石。所述发酵体系中所述L-谷氨酸的添加量具体为0.147g/L、0.294g/L、0.736g/L、1.472g/L、2.944g/L、3.675g/L；所述发酵体系中所述α-酮戊二酸的添加量具体为0.146g/L,0.292g/L,0.731g/L,1.461g/L,2.992g/L；所述发酵体系中所述沸石的添加量具体为1g/L、2g/L、5g/L、10g/L、20g/L；进一步的，所述发酵培养温度具体为30℃。上述所述酿酒酵母工程菌在制备2-苯乙醇中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术的有益效果：1、本专利技术提供的高产2-苯乙醇的酵母工程菌与宿主菌相比，合成2-苯乙醇的能力显著提高，且通过发酵体系的优化大大提高了底物转化率高，且该工程菌发酵条件简单，发本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高产2‑苯乙醇的酵母工程菌的制备方法，其特征在于：向受体酿酒酵母中导入转录激活因子Aro80基因和谷氨酸脱氢酶GdhA基因，得到高产2‑苯乙醇的酿酒酵母工程菌。
【技术特征摘要】
1.一种高产2-苯乙醇的酵母工程菌的制备方法，其特征在于：向受体酿酒酵母中导入转录激活因子Aro80基因和谷氨酸脱氢酶GdhA基因，得到高产2-苯乙醇的酿酒酵母工程菌。2.如权利要求1所述的一种高产2-苯乙醇的酵母工程菌的制备方法，其特征在于，所述转录激活因子Aro80是如下a)或b)的蛋白质：a）SEQIDNo.1所示的蛋白质；b）将SEQIDNo.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。3.如权利要求1所述的一种高产2-苯乙醇的酵母工程菌的制备方法，其特征在于，所述谷氨酸脱氢酶GdhA是如下a)或b)的蛋白质：a）SEQIDNo.2所示的蛋白质；b）将SEQIDNo.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。4.如权利要求1至3任一项所述的高产2-苯乙醇的酵母工程菌的制备方法，其特征在于：所述受体酿酒酵母为酿酒酵母YS58。5.如权利要求1-4任一项所述的方法得到的产2-苯乙醇的酿酒酵母工程菌。6.一种制备2-苯乙醇的的方法，其特征在于：将权利要求5所述的酿酒酵母工程...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨欣伟，林君如，张欣玥，杨雪翊，彭冠璇，柯崇榕，黄建忠，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：福建,35
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