一种利用无痕编辑技术提高二元酸产量的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用无痕编辑技术提高二元酸产量的方法。基于CRISPR‑Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体在提高二元酸产量中的应用，所述基于CRISPR‑Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术构建的载体包含Cas9、sgRNA、同源臂、正向筛选标记、原核生物的复制起始位点。经检测，使用本发明专利技术制得的重组菌株可大幅提高二元酸的产量，为工业化生产二元酸奠定了基础，同时也为其他酵母、谷氨酸棒状杆菌、大肠杆菌等微生物基因的无痕编辑提供了应用借鉴。

A Method of Improving Binary Acid Production by Traceless Editing Technology

The invention relates to a method for improving the output of binary acid by using traceless editing technology. The application of traceless editing vector of Candida tropicalis genome based on RISPR_Cas9 in improving binary acid production. The nucleotide sequence of traceless editing vector of Candida tropicalis genome based on RISPR_Cas9 is shown in SEQ ID NO.1. The vector constructed by the invention comprises Cas9, sgRNA, homologous arm, forward screening marker and prokaryotic replication initiation site. After detection, the recombinant strain prepared by the method can greatly increase the production of dibasic acid, lay a foundation for industrial production of dibasic acid, and provide application reference for traceless editing of other microbial genes such as yeast, Corynebacterium glutamate, Escherichia coli and so on.

【技术实现步骤摘要】
一种利用无痕编辑技术提高二元酸产量的方法
本专利技术涉及一种利用无痕编辑技术提高二元酸产量的方法，属于生物工程

技术介绍
长链二元酸(Long-chaindicarboxylicacid，DCA)是指碳链中含有10个以上碳原子的脂肪族二羧酸，包括不饱和二元酸。它们是一类有着重要和广泛工业用途的精细化工产品，是化学工业中合成高级香料、高性能尼龙工程塑料、高档尼龙热熔胶、高温电介质、高级油漆和涂料、高级润滑油、耐寒性增塑剂、树脂、医药和农药等的重要原料，同时也可作为生产不10-HDA、羟基脂肪酸、不饱和二元酸等脂肪酸衍生物的原料。目前长链二元酸的生产主要依赖微生物发酵法获取。微生物发酵法主要依赖于微生物特有的氧化能力及其胞内酶的作用，通过增强α及ω氧化的方法，阻断二元酸分解途径，在常温常压下将油脂或者烷烃或者一元羧酸等为生产原料转化为二元羧酸的技术。最初长链二元酸生产技术自20世纪60年代兴起，随后日本、美国和德国等国家开始由相关技术的基础理论研究转入应用开发研究，主要涉及十二碳二元酸(DC12)、十三碳二元酸(DC13)、十四碳二元酸(DC14)和十六碳二元酸(DC16)的生产。目前国内已经实现了以烷烃为底物发酵生产长碳链二元酸的产业化，生物法制备得到十一至十四碳二元酸已投放市场。如中国专利文献CN1570124A(申请号2004100182557)、中国专利文献CN1844404A(申请号CN200610038331X)、中国专利文献CN101225411A(申请号2007101958427)、中国专利文献CN102115769A(申请号2009102565907)、中国专利文献CN102115768A(申请号2009102565890)、中国专利文献CN102115766A(申请号2009102565871)、中国专利文献CN102115765A(申请号2009102565867)、中国专利文献CN102061316A(申请号2010101603101)和中国专利文献CN103805642A(申请号2012104397995)等。现阶段增加长链二元酸产量的方法是利用同源重组的原理进行减少或增加目的基因的拷贝数，从而增加二元酸的产量，如中国专利文献CN103992959A(申请号2014101755564)通过增加一个拷贝的CYP单加氧酶基因提高热带假丝酵母长链二元酸的产率，中国专利文献CN106754979A(申请号201611218540.2)通过增加长链二元酸转运基因fatlp的拷贝数或者更换启动子增加fatlp基因的过表达。但由于微生物发酵法生产长链二元酸的主要菌种热带假丝酵母为二倍体，利用这种传统基因编辑的方法，不但效率不高，并且转化率与理论转化率相比依然还有较大的提升空间。酵母作为一种微生物工程菌，在生产脂肪酸等方面一直以来受到很大关注，相比较大肠杆菌，酵母中有蛋白质加工等相关系统，表达的蛋白等产物往往接近天然产物，生物活性好。热带假丝酵母作为一种非常规酵母，具有很高的合成、修饰和储存细胞内脂质的能力，具备较高的脂肪酸衍生物，如：二元酸、ω-羟基脂肪酸、10-羟基-2-癸烯酸、氨基脂肪酸等生产能力或生产潜力，但一直缺乏一种高效无痕的编辑系统对其进行基因编辑，本专利技术提供一种适用于热带假丝酵母的高效无痕的基因组编辑系统，这无疑具有巨大的应用前景。在近几年分子生物学中CRISPR-Cas9开始作为一种新的、高效率的基因编辑技术被广泛使用，仅在短短几年时间里已经在人体细胞、老鼠、斑马鱼、植物、细菌、真菌等多种生物中成功实现了对靶基因的定向编辑，目前该技术已成为基因编辑的首选技术。如中国专利文献CN105593367A(申请号CN201580000476.8)、中国专利文献CN105695485A(申请号CN201410606474.0)、中国专利文献CN105886498A(申请号CN201510240981.1)、中国专利文献CN105647962A(申请号CN201610085619.6)、中国专利文献CN105331607A(申请号CN201510688330.9)、中国专利文献CN105567738A(申请号CN201610028603.1)、中国专利文献CN105907758A(申请号CN201610330754.2)和国外专利文献WO2017092201(申请号WO2016CN77337)等。CRISPR-Cas9技术是在一个长约20bp左右的sgRNA引导下、利用特异的核酸酶实现对基因组进行编辑的新技术。CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术已经成为现代分子生物学和生物信息学的重要组成部分，为后期的进一步方法优化和改造提供了基础，如中国专利文献CN105907758A(申请号CN201610330754.2)则公开了一种CRISPR-Cas9引导序列及其引物、转基因表达载体及其构建方法。但CRISPR-Cas9技术尚无在热带假丝酵母中进行基因编辑的报道。目前尚有的微生物基因的无痕编辑主要通过正向筛选标记(一般为抗性基因或遗传缺陷型基因)以及反向筛选标记(果聚糖蔗糖酶编码基因sacB、毒素蛋白基因mazF)实现，这其中反向筛选标记的选择及使用极大的影响了微生物基因的无痕编辑的筛选效率，即便如此，利用现有反向筛选标记实现二次筛选仍然存在许多弊端，如需额外添加诱导物、诱导物添加的量难以控制、微生物对反向筛选标记的抗性容易积累等，往往会造成假阳性率高等问题，增加了后期筛选的难度。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种利用无痕编辑技术提高二元酸产量的方法。本专利技术的特点在于所提供的基因编辑系统是基于Cas9编辑系统，所采用的反向筛选标记为Cas9基因，即，Cas9基因具备基因编辑和反向筛选标记的双重功能。本专利技术技术方案如下：基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体在提高二元酸产量中的应用，所述基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。根据本专利技术优选的，所述应用，步骤如下：(1)制备热带假丝酵母的感受态细胞；(2)将上述基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体与步骤(1)制得的感受态细胞混合均匀后，进行电转化，制得转化细胞；(3)将转化细胞复苏培养后，在含G418浓度800～1000μg/mL的固体YPD培养基上进行筛选培养，筛选抗G418的菌株；(4)将步骤(3)制得的抗G418的菌株在含有5～15g/L半乳糖的筛选培养基筛选培养，制得编辑后的细胞；(5)将步骤(4)制得的编辑后的细胞在发酵培养基中进行发酵培养6～8d，经分离、纯化，制得二元酸。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中的热带假丝酵母为热带假丝酵母(Candidatropicalis)CICC1798。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中，制备热带假丝酵母的感受态细胞的具体步骤如下：取热带假丝酵母单菌落，培养至菌体浓度OD600为1.0～1.8，置于冰上冷却，离心，用预冷的电转缓冲液洗涤菌体3～5次，电转缓冲液重悬菌体，制得热带假丝酵母感受态细胞。根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中，电转化条件为：1300～180本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于CRISPR‑Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体在提高二元酸产量中的应用，所述基于CRISPR‑Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体在提高二元酸产量中的应用，所述基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤如下：(1)制备热带假丝酵母的感受态细胞；(2)将上述基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体与步骤(1)制得的感受态细胞混合均匀后，进行电转化，制得转化细胞；(3)将转化细胞复苏培养后，在含G418浓度800～1000μg/mL的固体YPD培养基上进行筛选培养，筛选抗G418的菌株；(4)将步骤(3)制得的抗G418的菌株在含有5～15g/L半乳糖的筛选培养基筛选培养，制得编辑后的细胞；(5)将步骤(4)制得的编辑后的细胞在发酵培养基中进行发酵培养6～8d，经分离、纯化，制得二元酸。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中的热带假丝酵母为热带假丝酵母(Candidatropicalis)CICC1798。4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中，制备热带假丝酵母的感受态细胞的具体步骤如下：取热带假丝酵母单菌落，培养至菌体浓度OD600为1.0～1.8，置于冰上冷却，离心，用预冷的电转缓冲液洗涤菌体3～5次，电转缓冲液重悬菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：范翰，修翔，汪俊卿，王瑞明，李丕武，杨晓慧，薛乐，张丽华，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37