一种促进马克斯克鲁维酵母目的基因的表达的载体制造技术

本发明专利技术公开了一种促进马克斯克鲁维酵母目的基因的表达的载体。该载体的核苷酸序列如序列表中序列1所示。根据HSF1基因转录起始位点的核苷酸序列，设计靶向HSF1基因的sgRNA特征序列(核苷酸序列如序列表中序列2所示)；将载体自5’至3’起第11874至11881位所示的DNA小片段替换为序列表中序列2所示的核苷酸序列的反向互补序列，得到重组质粒；向马克斯克鲁维酵母中导入重组质粒，得到重组马克斯克鲁维酵母。与马克斯克鲁维酵母相比，重组马克斯克鲁维酵母中HSF1基因的相对表达量显著增加。由此可见，本发明专利技术提供的载体可以用于促进马克斯克鲁维酵母目的基因的表达。本发明专利技术具有重要的应用价值。

A Vector for Promoting the Expression of Target Genes in Maxkluyveromyces cerevisiae

The present invention discloses a vector for promoting the expression of target gene of Maxkluyveromyces cerevisiae. The nucleotide sequence of the vector is shown as sequence 1 in the sequence list. According to the nucleotide sequence of the transcription initiation site of HSF1 gene, the specific sequence of sgRNA targeting HSF1 gene (nucleotide sequence as shown in sequence 2 in sequence table) was designed. The small DNA fragments shown in position 11874 to 11881 of vector from 5'to 3' were replaced by the reverse complementary sequence of nucleotide sequence shown in sequence 2 in sequence table, and the recombinant plasmid was obtained. The recombinant plasmid was introduced into the yeast of Kruveria max. The recombinant yeast was obtained from the plasmid. Compared with the recombinant yeast, the relative expression of HSF1 gene in recombinant yeast increased significantly. Thus, the vector provided by the invention can be used to promote the expression of the target gene of Maxkluyveromyces cerevisiae. The invention has important application value.

【技术实现步骤摘要】
一种促进马克斯克鲁维酵母目的基因的表达的载体
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种促进马克斯克鲁维酵母目的基因的表达的载体。
技术介绍
马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)能够在高达45℃条件下生长并进行乙醇发酵，其在分类学上与酿酒酵母具有一定的亲缘性，并与乳酸克鲁维酵母一样获得美国食品添加剂的安全性指标(GenerallyRegardedasSafe，GRAS)认证和欧洲“安全资格认定”(QualifiedPresumptionofSafety，QPS)认证。与前两者相比，马克斯克鲁维酵母因其可利用底物广泛、生长速率快、耐热、蛋白分泌能力强以及更适合于生物工程改造与应用而备受工业生产的青睐。CRISPR/Cas9系统是原核微生物(细菌和古生菌)抵御外部遗传元件(如质粒和噬菌体)的一种免疫系统。其中，CRISPR即成簇规律间隔短回文重复序列(Clusteredregularly-interspacedshortpalindromicrepeats)的英文缩写，Cas为CRISPR关联蛋白(CRISPR-associated)的英文缩写。CRISPR/Cas9系统仅仅依赖单一蛋白Cas9，由一个crRNA(CRISPR-derivedRNA)和一个tracrRNA(trans-activatingRNA)融合形成的sgRNA(singleguideRNA)引导Cas9对DNA上与sgRNA互补的目的DNA中前20个nt靶定特征序列进行识别与切割，从而引入一个DNA双键断裂(DSB)。研究表明，通过失活Cas9的核酸内切酶的活性而获得了deadCas9(dCas9)，dCas9只会在sgRNA的引导下特异性的结合到目的位点，而不会产生切割。
技术实现思路
本专利技术的目的是在马克斯克鲁维酵母中促进目的基因表达。本专利技术首先保护一种载体，可包括表达盒甲和表达盒乙；所述表达盒甲依次可包括如下元件：启动子甲、dCas9蛋白的编码基因、转录激活因子和终止序列甲；所述表达盒乙依次可包括如下元件：启动子乙、sgRNA骨架结构和终止序列乙。所述启动子甲和所述启动子乙可以相同，也可以不同。所述终止序列甲和所述终止序列乙可以相同，也可以不同。所述表达盒甲中，dCas9蛋白的氨基酸序列可如序列表中的序列6所示。dCas9蛋白的编码基因可如序列表中序列1自5’末端起第7171至11271位所示。所述表达盒甲中，转录激活因子可为转录激活因子VP64。所述转录激活因子VP64的核苷酸序列可如序列表中序列1自5’末端起第11308至11457位所示。所述表达盒甲中还可包括一个以上细胞核定位序列。所述细胞核定位序列可为细胞核定位序列SV40。细胞核定位序列SV40的氨基酸序列可为Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val。所述表达盒甲中具体可包括一个细胞核定位序列SV40。所述细胞核定位序列SV40的核苷酸序列可如序列表中序列1自5’末端起第7141至7161位所示。该细胞核定位序列SV40具体可位于启动子甲的下游、dCas9蛋白的编码基因的上游。所述表达盒甲中，启动子甲可为ADH1启动子。终止序列甲可为ADH1终止子。所述ADH1启动子的核苷酸序列可如序列表中序列1自5’末端起第6715至7110位所示。所述ADH1终止子的核苷酸序列可如序列表中序列1自5’末端起第11473至11660位所示。所述表达盒乙中，sgRNA骨架结构的核苷酸序列可如序列表中序列1自5’末端起第11791至11873位的反向互补序列所示。所述表达盒乙中，所述启动子乙可为KmSNR52启动子。所述终止序列乙可为SUP4终止子。所述KmSNR52启动子的核苷酸序列可如序列表中序列1自5’末端起第11882至12412位的反向互补序列所示。所述SUP4终止子的核苷酸序列可如序列表中序列1自5’末端起第11778至11788位的反向互补序列所示。所述表达盒乙中，启动子乙和sgRNA骨架结构之间中可具有单克隆位点。所述单克隆位点具体可为限制性内切酶NotI的酶切位点。上述任一所述表达盒甲的核苷酸序列如序列表中序列1自5’末端起第6715至11660位所示。上述任一所述表达盒乙的核苷酸序列可如序列表中序列1自5’末端起第11778至12412位的反向互补序列所示。上述任一所述载体还可包括表达盒丙；所述表达盒丙依次可包括如下元件：启动子丙、选择标记基因和终止序列丙。所述表达盒丙中，选择标记基因可为G418抗性基因。所述G418抗性基因可为kanMX6基因。上述任一所述表达盒丙的核苷酸序列如序列表中序列1自5’末端起第4348至5704位所示。上述任一所述载体还可包括特异序列；所述特异序列的功能可为细胞分裂时进行自主复制。所述细胞可为酵母细胞。所述酵母可为马克斯克鲁维酵母。所述特异序列可包括自主复制序列和着丝粒序列。所述特异序列的核苷酸序列可如序列表中序列1自5’末端起第2457至3723位所示。上述任一所述的载体的核苷酸序列具体可如序列表中序列1所示。本专利技术还保护X1)或X2)。X1)上述任一所述载体在促进目的基因的表达中的应用。X2)上述任一所述载体在促进酵母目的基因的表达中的应用。本专利技术还保护促进酵母中目的基因表达的方法。本专利技术所保护的促进酵母中目的基因表达的方法，具体为方法一，可包括如下步骤：将上述任一所述载体中表达盒乙的单克隆位点替换为sgRNA特征序列，然后转化出发酵母，筛选，得到重组酵母；所述sgRNA特征序列在出发酵母中的识别的靶标DNA为目的基因转录起始位点上游300bp至下游100bp的DNA片段；与出发酵母相比，重组酵母中目的基因的表达量增加。本专利技术所保护的促进酵母中目的基因表达的方法，具体为方法二，可包括如下步骤：向上述任一所述载体中的启动子乙的下游、sgRNA骨架结构的上游导入sgRNA特征序列，然后转化出发酵母，筛选，得到重组酵母；所述sgRNA特征序列在出发酵母中的识别的靶标DNA为目的基因转录起始位点上游300bp至下游100bp的DNA片段；与出发酵母相比，重组酵母中目的基因的表达量增加。上述任一所述的方法中，所述筛选为借助选择标记基因进行筛选。上述任一所述的方法中，所述sgRNA特征序列在酵母基因组中识别的靶标DNA具有如下结构5’-N20NGG-3’或5’-N20NAG-3’，N为A、G、C或T。在本专利技术的一个实施例中，上述任一所述目的基因可为HSF1基因。上述任一所述酵母可为马克斯克鲁维酵母。在本专利技术的实施例中，根据HSF1基因(genebank号为：AP012213.1)转录起始位点上游300bp至下游100bp的核苷酸序列，设计靶向HSF1基因的sgRNA特征序列gHSF1，gHSF1的核苷酸序列如序列表中序列2所示；然后将pKmCRPa质粒(序列表中序列1所示)自5’至3’起第11874至11881位所示的DNA小片段替换为序列表中序列2所示的核苷酸序列的反向互补序列，得到重组质粒pKmCRPa-gHSF1；向马克斯克鲁维酵母中导入重组质粒pKmCRPa-gHSF1，得到重组马克斯克鲁维酵母。与马克斯克鲁维酵母相比，重组马克斯克鲁维酵母中HSF1基因的相对表达量显著增加。由此可见，本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种载体，包括表达盒甲和表达盒乙；所述表达盒甲依次包括如下元件：启动子甲、dCas9蛋白的编码基因、转录激活因子和表达盒甲；所述表达盒乙依次包括如下元件：启动子乙、sgRNA骨架结构和终止序列乙。

【技术特征摘要】
1.一种载体，包括表达盒甲和表达盒乙；所述表达盒甲依次包括如下元件：启动子甲、dCas9蛋白的编码基因、转录激活因子和表达盒甲；所述表达盒乙依次包括如下元件：启动子乙、sgRNA骨架结构和终止序列乙。2.如权利要求1所述的载体，其特征在于：所述表达盒甲中，dCas9蛋白的氨基酸序列如序列表中的序列6所示。3.如权利要求1或2所述的载体，其特征在于：所述表达盒甲中还包括一个以上细胞核定位序列。4.如权利要求1至3任一所述的载体，其特征在于：所述表达盒乙中，启动子乙和sgRNA骨架结构之间中具有单克隆位点。5.如权利要求1至4任一所述的载体，其特征在于：所述启动子甲为ADH1启动子；所述启动子乙为KmSNR52启动子；所述终止序列甲为ADH1终止子；所述终止序列乙为SUP4终止子。6.如权利要求1至5任一所述的载体，其特征在于：所述载体还包括表达盒丙；所述表达盒丙依次包括如下元件：启动子丙、选择标记基因和终止序列丙。7.如权利要求1至6任一所述的载体，其特征在于：所述载体还包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：李十中，李鹏松，付晓芬，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京,11