一种产壳聚糖酶的重组菌的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开一种产壳聚糖酶的重组菌的构建方法及其应用。本发明专利技术将枯草芽孢杆菌壳聚糖酶基因和透明颤菌血红蛋白基因在毕赤酵母中共表达，重组菌株经高密度发酵策略高效制备壳聚糖酶。利用该方法制备壳聚糖酶的酶活力高达50000U/mL以上，蛋白含量为高达16.0mg/mL。重组酶比酶活力为4065.7U/mg，最适pH为6.0，最适温度为55℃。利用该酶水解高浓度(≥10％)壳聚糖制备壳寡糖，壳寡糖得率大于75％，主要产物为二糖、三糖和四糖。本发明专利技术的壳聚糖酶制备方法产酶水平远远高于现有文献和专利的报道，且所产酶具有优异的水解特性，在工业生产壳聚糖酶及制备壳寡糖中具有很好的应用价值。

Construction and application of a Chitosanase-producing recombinant strain

The invention discloses a construction method of a Chitosanase-producing recombinant bacteria and its application. The invention co-expresses the chitosanase gene of Bacillus subtilis and the hemoglobin gene of Vibrio hyalurona in Pichia pastoris, and the recombinant strain can efficiently prepare chitosanase by high-density fermentation strategy. The enzyme activity and protein content of chitosanase prepared by this method were over 50 000 U/mL and 16.0 mg/mL respectively. The specific activity of recombinant enzyme was 4065.7U/mg, the optimum pH was 6.0, and the optimum temperature was 55 C. Chitosan oligosaccharides were prepared by hydrolysis of chitosan with high concentration (> 10%). The yield of chitosan oligosaccharides was more than 75%. The main products were disaccharides, trisaccharides and tetrasaccharides. The chitosanase preparation method of the present invention has much higher enzyme production level than the existing literature and patent reports, and the produced enzyme has excellent hydrolysis characteristics, and has good application value in industrial production of chitosanase and preparation of chitosan oligosaccharides.

【技术实现步骤摘要】
一种产壳聚糖酶的重组菌的构建方法及其应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种产壳聚糖酶的重组菌的构建方法及其应用。
技术介绍
壳聚糖是几丁质部分脱乙酰的产物，由D-氨基葡萄糖和N-乙酰-D-氨基葡萄糖以β-1,4-糖苷键随机连接而成的直链天然多糖。壳聚糖酶(EC3.2.1.132)是专一水解壳聚糖的酶类，从壳聚糖链中随机切割β-1,4-糖苷键，产物为壳寡糖及氨基葡萄糖。基于其序列同源性，壳聚糖酶被划分为糖苷水解酶(GlycosideHydrolases，GH)5、7、8、46、75和80家族(Thadathiletal.FoodChemistry,2014,150:392–399)。近年来已有许多微生物产壳聚糖酶的文献和专利报道，但是大多数产酶水平偏低，难以用于工业化生产，仅一些微生物产壳聚糖酶的水平较高。如专利CN102399727A公开了一种枯草芽孢杆菌利用魔芋粉为碳源产壳聚糖酶的方法，酶活力为11762U/mL。Chen等将烟曲霉壳聚糖酶基因在巴斯德毕赤酵母中异源表达，酶活力为25000U/mL(Chenetal.BiotechnologyLetters,2012,34:689-694)，这是目前已报道壳聚糖酶的最高产酶水平。巴斯德毕赤酵母作为一种成熟、高效的表达系统，已广泛用于生产各种异源蛋白，高细胞密度发酵是获得高产量重组蛋白的有效方法。然而，高细胞密度培养需要大量氧气，致使甲醇诱导期间容易形成溶氧限制，并且由于生物量和消泡剂的增加，氧气的溶解度和传质效率逐渐降低，影响细胞生物量及目的蛋白的表达量(Yangetal.,BiotechnologyAdvances,2017,36(1):182-195)。透明颤菌(Vitreoscillastercoraria)血红蛋白能够促进氧气输送从而改善细胞呼吸和能量代谢。已有研究将其与半乳糖苷酶、磷脂酶等共表达改善高密度发酵时的溶氧限制问题，使细胞生物量和目的蛋白表达量大幅度提高(Wuetal.,JournalofBioscience&Bioengineering,2012,113:332-337；Wangetal.,EnzymeandMicrobialTechnology,2012,50:22-28)。虽然许多壳聚糖酶基因被克隆表达，但未见利用共表达透明颤菌血红蛋白以提高壳聚糖酶表达水平的相关文献及专利报道。壳寡糖是壳聚糖降解的产物，聚合度(degreeofpolymerization，DP)一般在2-10之间，其分子量低，水溶性好，具有许多生理活性，如抑菌性、抗氧化、抗肿瘤、降胆固醇、降血压、防感染以及控制关节炎等，广泛应用于食品、医药、农业和化妆品等行业(Liaqatetal.CarbohydratePolymers,2018:184-243)。壳寡糖制备方法主要有酶法、物理法和化学法。其中酶法具有环境友好、反应条件温和、产物组成理想等优点，是广泛应用和最具发展潜力的壳寡糖制备方法(Cabreraetal.BiochemicalEngineeringJournal,2005,25:165-172)。虽然酶法制备壳寡糖具有很多优点，但也存在许多不足。首先，壳聚糖酶产酶水平低是酶法水解壳聚糖的应用瓶颈；其次，已有酶法转化相关报道中采用的底物浓度低，导致后期浓缩成本高，生产效率低。目前，酶水解法采用的底物浓度一般为2-5％。虽然，Chen等报道的底物浓度为10％，但是需要超过24h的水解，能耗和成本均大幅度增加(Chenetal.BiotechnologyLetters,2012,34:689-694)。因此，提高壳聚糖酶的产酶水平和优化水解工艺是实现壳聚糖酶工业生产壳寡糖的关键。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种产壳聚糖酶的重组菌的构建方法。本专利技术提供的产壳聚糖酶的重组菌的构建方法包括如下步骤：将枯草芽孢杆菌壳聚糖酶基因和透明颤菌血红蛋白基因导入毕赤酵母，得到所述产壳聚糖酶的重组菌。上述重组菌的构建方法中，所述枯草芽孢杆菌壳聚糖酶基因为如下a1)或a2)或a3)：a1)序列1所示的DNA分子；a2)在严格条件下与a1)限定的DNA分子杂交且编码所述枯草芽孢杆菌壳聚糖酶的DNA分子；a3)与a1)或a2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述枯草芽孢杆菌壳聚糖酶的DNA分子；所述透明颤菌血红蛋白基因为如下b1)或b2)或b3)：b1)序列2所示的DNA分子；b2)在严格条件下与b1)限定的DNA分子杂交且编码所述透明颤菌血红蛋白的DNA分子；b3)与b1)或b2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述透明颤菌血红蛋白的DNA分子。进一步的，所述枯草芽孢杆菌壳聚糖酶基因通过重组表达载体pPICZA-BsCsn46导入所述毕赤酵母中；所述重组表达载体pPICZA-BsCsn46为将序列1所示的DNA分子替换pPICZA载体EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点间的小片段后得到的载体；所述透明颤菌血红蛋白基因通过重组表达载体pPIC3.5K-VHb导入所述毕赤酵母中；所述重组表达载体pPIC3.5K-VHb为将序列2所示的DNA分子替换pPIC3.5K载体EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点间的小片段后得到的载体。更进一步的，所述枯草芽孢杆菌壳聚糖酶基因通过重组表达载体pPICZA-BsCsn46导入巴斯德毕赤酵母GS115中，构建得到重组菌GS115/BsCsn46；所述透明颤菌血红蛋白基因通过重组表达载体pPIC3.5K-VHb导入所述重组菌GS115/BsCsn46中，得到所述产壳聚糖酶的重组菌。上述重组菌的构建方法中，所述毕赤酵母可为巴斯德毕赤酵母；所述巴斯德毕赤酵母具体可为巴斯德毕赤酵母GS115。本专利技术另一个目的是提供如下(1)-(4)任一所述的生物材料：(1)采用上述构建方法构建得到的产壳聚糖酶的重组菌；(2)上述枯草芽孢杆菌壳聚糖酶基因；(3)上述透明颤菌血红蛋白基因；(4)含有(2)所述的枯草芽孢杆菌壳聚糖酶基因和/或(3)所述的透明颤菌血红蛋白基因的表达盒、重组载体和重组菌。本专利技术又有一个目的是提供上述生物材料的新用途。本专利技术提供了上述生物材料在制备壳聚糖酶中的应用。本专利技术还提供了上述生物材料在水解壳聚糖中的应用。本专利技术还提供了上述生物材料在制备壳寡糖中的应用。本专利技术还有一个目的是提供一种壳聚糖酶的制备方法。本专利技术提供的壳聚糖酶的制备方法包括如下步骤：将采用上述构建方法构建得到的产壳聚糖酶的重组菌进行发酵培养，得到发酵产物，从所述发酵产物中制得壳聚糖酶。上述壳聚糖酶制备方法中，所述发酵培养采用高密度发酵方法，所述高密度发酵方法及培养基具体可参照PichiaFermentationProcessGuideline(Invitrogen)中的发酵方法。进一步的，所述发酵培养的方法包括如下步骤：1)将上述重组菌接种至种子培养基中，培养至OD600为8-12时，得到种子液；2)将所述种子液接种至含有甘油的发酵培养基中进行发酵培养，待培养体系中甘油耗尽时开始流加甘油溶液；3)待培养体系中菌体湿重达到(200-250)g/L时停止流加甘油溶液，饥饿菌株(20-40)min后开始流加甲醇溶液进行诱导培养。更进一步的，所述1)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产壳聚糖酶的重组菌的构建方法，包括如下步骤：将枯草芽孢杆菌壳聚糖酶基因和透明颤菌血红蛋白基因导入毕赤酵母，得到所述产壳聚糖酶的重组菌。

【技术特征摘要】
1.一种产壳聚糖酶的重组菌的构建方法，包括如下步骤：将枯草芽孢杆菌壳聚糖酶基因和透明颤菌血红蛋白基因导入毕赤酵母，得到所述产壳聚糖酶的重组菌。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌壳聚糖酶基因为如下a1)或a2)或a3)：a1)序列1所示的DNA分子；a2)在严格条件下与a1)限定的DNA分子杂交且编码所述枯草芽孢杆菌壳聚糖酶的DNA分子；a3)与a1)或a2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述枯草芽孢杆菌壳聚糖酶的DNA分子；所述透明颤菌血红蛋白基因为如下b1)或b2)或b3)：b1)序列2所示的DNA分子；b2)在严格条件下与b1)限定的DNA分子杂交且编码所述透明颤菌血红蛋白的DNA分子；b3)与b1)或b2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述透明颤菌血红蛋白的DNA分子。3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌壳聚糖酶基因通过重组表达载体pPICZA-BsCsn46导入所述毕赤酵母中；所述透明颤菌血红蛋白基因通过重组表达载体pPIC3.5K-VHb导入所述毕赤酵母中；所述重组表达载体pPICZA-BsCsn46为将序列1所示的DNA分子替换pPICZA载体EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点间的小片段后得到的载体；所述重组表达载体pPIC3.5K-VHb为将序列2所示的DNA分子替换pPIC3.5K载体EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点间的小片段后得到的载体。4.根据权利要求1-3任一所述的构建方法，其特征在于：所述毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母；所述巴斯德毕赤酵母具体为巴斯德毕赤酵母GS115。5.如下(1)-(4)...

【专利技术属性】
技术研发人员：江正强，马帅，杨绍青，刘翊昊，闫巧娟，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11