一种降低黄酒酵母尿素积累的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种降低黄酒酵母尿素积累的方法及应用，属于遗传工程领域。本发明专利技术是以重组黄酒酵母JNZ01(MATa,Δura3,Δtrp1,TOR1S1972R,Δfpr1)作为出发菌株，在基因组上融合表达DAL80、FKBP12、在质粒上融合表达RPS1B、FRB，通过添加雷帕霉素，使FKBP12和FRB结合。在此基础上，Dal80在细胞质定位蛋白Rps1B的作用下，转移到细胞质，激活尿素利用相关基因的转录，使发酵过程中尿素的积累降低42.43％，降低到9.39mg/L。

A Method for Reducing Urea Accumulation in Rice Wine Yeast and Its Application

The invention discloses a method for reducing urea accumulation of rice wine yeast and its application, which belongs to the field of genetic engineering. The invention takes recombinant yellow rice wine yeast JNZ01 (MATa, ura3, trp1, TOR1S1972R, fpr1) as the starting strain, fuses and expresses DAL80, FKBP12 in genome, RPS1B and FRB in plasmid, and combines FKBP12 and FRB by adding rapamycin. On this basis, under the action of Rps1B, Dal80 was transferred to the cytoplasm to activate the transcription of urea-related genes, which reduced urea accumulation by 42.43% and 9.39 mg/L during fermentation.

【技术实现步骤摘要】
一种降低黄酒酵母尿素积累的方法及应用
本专利技术涉及一种降低黄酒酵母尿素积累的方法及应用，属于遗传工程领域。
技术介绍
小分子介导的蛋白二聚化是广泛应用于调控蛋白亚细胞定位的有效手段之一。雷帕霉素可以使FK506结合蛋白——FKBP12与mTor的FBR亚基结合，形成异源二聚体。以此为基础，通过将目的蛋白与FKBP12蛋白融合表达、将已知亚细胞定位的锚定蛋白与FBR亚基融合，在雷帕霉素的介导下，可以形成目的蛋白-FKBP12-雷帕霉素-FBR-锚定蛋白复合体。目的蛋白在锚定蛋白的作用下，定位到目标亚细胞器中。Dal80是酿酒酵母氮代谢阻遏效应全局调控因子之一，主要在细胞核内通过与相关基因启动子区域的结合，阻遏基因的转录表达。黄酒生成是酿酒酵母的发酵过程，受氮代谢阻遏效应的影响，尿素等非偏好型氮源在发酵过程中利用滞后，最终在发酵体系中积累。积累的尿素与乙醇自发反应会生成2A类潜在致癌物质氨基甲酸乙酯，严重影响黄酒产品的安全性。因此阻止转录阻遏因子Dal80进入细胞核，消除Dal80对尿素利用相关基因表达的阻遏作用，是降低黄酒发酵过程中氨基甲酸乙酯前体物质——尿素积累的途径之一。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种降低黄酒酵母尿素积累的方法，通过添加雷帕霉素调控Dal80定位于细胞质，降低黄酒酵母发酵过程中尿素的积累。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法在黄酒酵母基因组上，融合表达DAL80、FKBP12，同时在质粒载体上融合表达RPS1B、FBR亚基，在雷帕霉素作用下，形成Dal80-FKBP12-雷帕霉素-Rps1B-FBR蛋白复合体，使Dal80在Rps1B蛋白的作用下定位于细胞质中，无法进入细胞核，降低黄酒发酵过程中尿素的积累。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法在黄酒酵母基因组上融合表达DAL80、FKBP12、在质粒上融合表达RPS1B、FRB，通过添加雷帕霉素，使FKBP12和FRB结合，并使Dal80在细胞质定位蛋白Rps1B的作用下，转移到细胞质。本专利技术的第二个目的是提供一种构建黄法酒酵母中尿素含量降低的黄酒酵母，主要包括如下步骤：(1)构建DAL80、FKBP12重组框；(2)通过CRISPR-Cas9系统将DAL80、FKBP12重组框整合到重组黄酒酵母JNZ01(MATa,Δura3,Δtrp1,TOR1S1972R,Δfpr1)基因组DAL80基因之后，得到重组黄酒酵母JNZ8(MATa,Δura3,Δtrp1,TOR1S1972R,Δfpr1,DAL80::FKBP12)；(3)消除CRISPR-Cas9系统质粒；(4)构建RPS1B、FRB融合表达框；(5)将RPS1B、FRB融合表达框插入游离高拷贝表达质粒pRS426-TEF-URA3中，得到重组质粒pRS426-TEF-Rps1B-FRB-URA3，转化重组黄酒酵母JNZ8得到JNZ9(MATa,Δura3,Δtrp1,TOR1S1972R,Δfpr1,DAL80::FKBP12,pRS426-TEF-Rps1B-FRB-URA3)；(6)在重组黄酒酵母的培养过程中，向培养基中添加雷帕霉素，诱导Dal80定位于细胞质。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法具体为：(1)通过融合PCR构建DAL80、FKBP12重组框；(2)通过CRISPR-Cas9系统将DAL80、FKBP12重组框整合到重组黄酒酵母JNZ01(MATa,Δura3,Δtrp1,TOR1S1972R,Δfpr1)基因组DAL80基因之后，得到重组黄酒酵母JNZ8(MATa,Δura3,Δtrp1,TOR1S1972R,Δfpr1,DAL80::FKBP12)；(3)通过在YPD培养基中传代，丢失CRISPR-Cas9系统质粒，在5-FOA和5-FAA平板上进行筛选；(4)通过融合PCR构建RPS1B、FRB融合表达框；(5)通过酶切连接将RPS1B、FRB融合表达框插入游离高拷贝表达质粒pRS426-TEF-URA3中，得到重组质粒pRS426-TEF-Rps1B-FRB-URA3，转化重组黄酒酵母JNZ8得到JNZ9(MATa,Δura3,Δtrp1,TOR1S1972R,Δfpr1,DAL80::FKBP12,pRS426-TEF-Rps1B-FRB-URA3)。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组黄酒酵母JNZ01的构建方法为：以黄酒酵母XZ-11为出发菌株，敲除其FPR1基因，并突变TOR1基因编码的蛋白第1972位丝氨酸残基为精氨酸。本专利技术的第三个目的是提供应用所述方法构建的黄酒酵母。本专利技术的第四个目的是提供所述黄酒酵母在食品领域的应用。本专利技术还要求保护所述黄酒酵母在黄酒生产领域的应用。有益效果：本专利技术提供的通过雷帕霉素介导Dal80与Rps1B的二聚化降低黄酒酵母尿素积累的方法，可使构建的重组黄酒酵母发酵过程中尿素的积累降低42.43％，降低到9.39mg/L。附图说明图1雷帕霉素介导Dal80与Rps1B的二聚化对菌株尿素积累的影响；图2为调控Gzf3定位于细胞质对菌株尿素代谢相关基因表达的影响。具体实施方式实施例1适用于雷帕霉素介导调控蛋白亚细胞定位的黄酒酵母的构建(1)拆分用于黄酒生产的二倍体酿酒酵母菌株XZ-11获得单倍体菌株按论文“WuDH,LiXM,ShenC,etal.IsolationofahaploidfromanindustrialChinesericewineyeastformetabolicengineeringmanipulation[J].JournaloftheInstituteofBrewing,2013,119(4):288-293.”中所述方法及步骤获得不含抗性基因的单倍体XZ-11a菌株。(2)构建营养缺陷型单倍体黄酒酵母JNZ01以黄酒酵母XZ-11菌株基因组为模板，分别扩增URA3基因上、下游300bp序列，通过融合PCR将上述两个扩增片段融合得到URA3基因敲除框。将URA3敲除框转化XZ-11a菌株，在5-FOA平板(YNB1.7g/L，硫酸铵5g/L，葡萄糖20g/L，尿嘧啶25mg/L，5-FOA1g/L，琼脂粉20g/L)上筛选，获得尿嘧啶缺陷型菌株XZ-11a-ura3。以黄酒酵母XZ-11菌株基因组为模板，分别扩增TRP1基因上、下游300bp序列，通过融合PCR将上述两个扩增片段融合得到TRP1基因敲除框。将TRP1敲除框转化XZ-11a-ura3菌株，在5-FAA平板(YNB1.7g/L，硫酸铵5g/L，葡萄糖20g/L，尿嘧啶25mg/L，色氨酸25mg/L，5-FAA1g/L，琼脂粉20g/L)上筛选，获得尿嘧啶和色氨酸二重营养缺陷性菌株JNZ01(MATaΔura3,Δtrp1)。(3)构建pRS426-Tor1sgRNA-Fpr1sgRNA-URA3质粒首先根据Yeastriction(http://yeastriction.tnw.tudelft.nl/#！/)设计运用CRISPR-Cas9系统编辑基因组上FPR1和TOR1位点所需的20nt序列(FPR1：TTGGTTACCATTCATTACAC；TOR1：TGTTATGTTCAACGAAAAAT)。以质粒p426-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种降低黄酒酵母尿素积累的方法，其特征在于，通过在黄酒酵母培养过程添加雷帕霉素，调控Dal80定位于细胞质，降低黄酒酵母发酵过程中尿素的积累。

【技术特征摘要】
1.一种降低黄酒酵母尿素积累的方法，其特征在于，通过在黄酒酵母培养过程添加雷帕霉素，调控Dal80定位于细胞质，降低黄酒酵母发酵过程中尿素的积累。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述黄酒酵母的基因组上融合表达DAL80、FKBP12，并在质粒上融合表达RPS1B、FBR亚基；所述方法通过培养环境中的雷帕霉素，使Dal80在Rps1B蛋白的作用下定位于细胞质中，降低黄酒发酵过程中尿素的积累。3.一种构建尿素积累能力降低的黄酒酵母的方法，其特征在于，在黄酒酵母基因组上融合表达DAL80、FKBP12，并在质粒上融合表达RPS1B、FRB。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，主要包括如下步骤：(1)构建DAL80、FKBP12重组框；(2)通过CRISPR-Cas9系统将DAL80、FKBP12重组框整合到重组黄酒酵母JNZ01(MATa,Δura3,Δtrp1,TOR1S1972R,Δfpr1)基因组DAL80基因之后，得到重组黄酒酵母JNZ8(MATa,Δura3,Δtrp1,TOR1S1972R,Δfpr1,DAL80::FKBP12)；(3)消除CRISPR-Cas9系统质粒；(4)构建RP...

【专利技术属性】
技术研发人员：周景文，方芳，陈坚，张伟平，曾伟主，堵国成，夏小乐，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32