一种白色念珠菌的研究方法技术

本发明专利技术公开了一种白色念珠菌的研究方法，涉及生物技术领域。包括：采用PCR技术获得白色念珠菌的Iqg1p蛋白，以其为研究对象；采用基因敲除和荧光定位筛选出Iqg1p的IQ模体、GAP、GAPC三个功能区段；构建IQ模体、GAP、GAPC三个功能区段的体外表达质粒，获得各自空间结构；采用不同诱导培养基对区段敲除后菌株菌丝进行诱导，获得各区段敲除后菌株形成菌丝最佳诱导培养基；采用Western‑Blot检测Iqg1p的GAP功能区段与Cdc42p及Rho1p在体外相互作用，获得Iqg1p蛋白在白色念珠菌细胞生物学特性。本发明专利技术方法在白色念珠菌生物特性研究上具有完整性、准确性和科学性。

A Study Method of Candida albicans

The invention discloses a research method of Candida albicans, which relates to the field of biotechnology. These include: obtaining the Iqg1p protein of Candida albicans by PCR, screening three functional regions of Iqg1p: IQ motif, GAP and GAPC by gene knockout and fluorescence localization; constructing three functional regions of IQ motif, GAP and GAPC in vitro expression plasmids to obtain their spatial structure; using different induction media to induce the mycelium of the strain after knockout, and obtaining them. Western Blot was used to detect the interaction of GAP functional region of Iqg1p with CD42p and Rho1p in vitro, and the biological characteristics of Iqg1p protein in Candida albicans cells were obtained. The method has integrity, accuracy and scientificity in the study of biological characteristics of Candida albicans.

【技术实现步骤摘要】
一种白色念珠菌的研究方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种白色念珠菌的研究方法。
技术介绍
白色念珠菌，也被称为白色假丝酵母菌，此类真菌不仅会感染人的呼吸系统、消化系统、皮肤、粘膜、神经系统组织，它还可引起白色念珠菌病。在免疫力正常的人体中，它可引起皮肤黏膜浅部感染，但在免疫力低下的病人中，如艾滋病患者、化疗病人、器官移植病人等，白色念珠菌可侵入人体血液，导致致命性的深部感染，也称系统性感染。白色念珠菌是二倍体生物，呈革兰氏阳性。该菌的菌体为单细胞，呈现卯圆形、椭圆形等形状，可以在显微镜下观察到明显的牙管，直径一般分布在3～6μm之间，出芽方式繁殖，大多数是需氧型真菌。它的一个重要生物学特征是它能以单细胞的孢子体和多细胞的菌丝体等多种形态生长，这些形态可以同时并存于寄主体内。近年来随着对白色念珠菌致病机制过程的了解不断加深，治疗白色念珠菌感染的新疗法和诊断策略将不断增多。为了寻找新的有效治疗白色念珠菌感染的方法，对于白色念珠菌致病机理已有较多研究，但众多研究方法的准确性和科学性较低。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术实施例提供了一种白色念珠菌的研究方法，主要目的是解决白色念珠菌的研究方法不完善、准确性与科学性较低的问题。为达到上述目的，本专利技术主要提供了如下技术方案：一方面，本专利技术实施例提供了一种白色念珠菌的研究方法，包括以下步骤：采用PCR技术获得白色念珠菌的Iqg1p目的蛋白，以所述Iqg1p蛋白为研究对象；采用基因敲除和荧光定位技术对所述Iqg1p蛋白的CH、IQ、GAP及GAPC功能区段逐一敲除，筛选出对细胞形态具有重要意义的Iqg1p的IQ模体、GAP、GAPC三个功能区段；构建所述IQ模体、GAP、GAPC三个功能区段的体外表达质粒，获得各自空间结构；采用不同诱导培养基对区段敲除后的菌株菌丝进行诱导培养，获得各区段敲除后的菌株形成菌丝的最佳诱导培养基；采用Western-Blot检测所述Iqg1p的GAP功能区段与Cdc42p及Rho1p在体外的相互作用，获得Iqg1p蛋白在白色念珠菌中的细胞生物学特性。作为优选，所述诱导培养基为液体培养基和固体培养基；所述液体培养基为LB培养基、SOC培养基、Amp/Kan抗性培养基、YPD培养基、GMM培养基或Mal培养基；所述固体培养基为LB培养基、LB+Amp培养基、LB+Kan培养基、YPD培养基、GMM培养基、Mal培养基、YPD+10％牛血清培养基或Spider培养基。作为优选，所述LB培养基的配方：10gTryptone，5gYeastExtract，10gNaCl，加dH2O定容至1L，121℃灭菌20min；所述Amp/Kan抗性培养基的配方：在100mLLB液体培养基中加入100μL100mg/mLAmp或100mg/mLKan1；所述SOC培养基的配方：除含有20mmol/L葡萄糖外，其他成分与SOB培养基相同；20gTryptone，5gYeastExtract，0.5gNaCl，混匀使溶质充分溶解，加10mL250mmol/LKCl溶液，调pH为7.0，加dH2O定容至1L，121℃灭菌20min；溶液在使用前，加入5mL灭菌的2mol/LMgCl2，高温高压灭菌后的SOB培养基冷却至50℃左右，加20mL过滤除菌的1mol/L葡萄糖溶液，即为SOC培养基；所述YPD培养基的配方：20gPeptone，10gYeastExtract，20g葡萄糖，加dH2O定容至1L，115℃灭菌30min；所述10xGMM培养基的配方：200g葡萄糖，67gYeastNitrogenBasewithoutAminoAcids，加dH2O定容至1L，搅拌均匀，待其充分溶解，用0.22μm的滤膜过滤除菌，使用时稀释10倍即可；所述10xMal培养基的配方：200g麦芽糖，67gYeastNitrogenBasewithoutAminoAcids，加dH2O定容至1L，搅拌均匀，待其充分溶解，用0.22μm的滤膜过滤除菌，使用时稀释10倍即可；所述LB培养基、Amp/Kan抗性培养基、YPD培养基、GMM培养基、Mal培养基在液体培养基的基础上加入2％的琼脂粉即为固体培养基；所述YPD+10％牛血清固体培养基的配方：将高温高压灭菌后YPD固体培养基(90mL)冷却至50℃左右，加入10ml过滤除菌的胎牛牛血清蛋白，混匀后倒平板，每个平板约20mL左右；所述Spider培养基的配方：10g营养肉汤，10g甘露醇，2gK2HPO4，20g琼脂粉，调pH为6.8，加dH2O定容至1L，115℃灭菌30min。作为优选，所述采用PCR技术获得白色念珠菌的目的蛋白的具体过程包括：以提取的白色念珠菌基因组DNA为模板，利用上下游引物进行PCR扩增以获得目的片段；采用一步双酶法对所述目的基因和载体进行双酶切并进行酶连反应，获得连接产物，所述目的基因与所述载体的摩尔比为1-5∶1；转化所述连接产物，获得菌液；采用PCR鉴定所述菌液；筛选阳性克隆质粒后，抽提质粒，对质粒进行酶切验证，测序，将序列完整正确的重组质粒转入大肠杆菌表达型菌株Rosetta中，构建MBP-IQ、MBP-GAP、MBP-GAPC，pET28a-IQ、pET28a-GAP、pET28a-GAPC，GST-Cdc42及GST-Rho1蛋白的表达质粒；对目的蛋白进行表达与纯化；采用BCA技术测得纯化后目标蛋白的浓度；采用悬滴技术获得所述目标蛋白的最佳结晶体。作为优选，所述采用基因敲除技术和荧光定位技术对所述Iqg1p蛋白的CH、IQ、GAP及GAPC功能区段逐一敲除，筛选出对细胞形态具有重要意义的Iqg1p的IQ模体、GAP、GAPC三个功能区段的具体过程包括：首先根据待敲除目的基因设计其左右同源臂的引物，然后用easy-taq酶分别扩增出左右同源臂序列AB、CD；再将二者进行融合PCR形成AD目的片段；将AD连接到T-Vector上进行酶连接；挑取阳性克隆鉴定，抽质粒，获得基因敲除质粒，构建Iqg1、Rho1、Rho1-shutoff质粒；采用改进的醋酸锂转化技术将所述基因敲除质粒导入到白色念珠菌中进行同源置换，获得目标菌落；对所述目标菌落进行阳性克隆鉴定，获得阳性目标菌落。作为优选，对于所述Iqg1p的IQ、GAP区段敲除基因序列，由于太长，采用了改进的融合PCR；具体步骤如下：应用特异性引物，对各片段进行独立扩增，特异性引物的5′-末端带有一段相邻片段的互补序列；添加第一步反应的已纯化产物，不添加引物，通过10～13个循环，复性延伸片段之间的重叠部分；将第二步反应的未纯化产物，添加外侧引物通过25～30个循环进行融合片段的全长扩增，获得目的片段后，分别将其连接到改造后的CIp10质粒，标记上GFP蛋白。作为优选，所述采用Western-Blot检测所述Iqg1p的GAP功能区段与Cdc42p及Rho1p在体外的相互作用的具体过程包括：(1)建立Cdc42p、Rho1p过表达突变体：首先设计引物，分别将Cdc42p、Rho1p克隆到CIp10质粒质粒上，使蛋白质在N端标记上荧光蛋白；然后根据定点突变引物设计原则设计突变引物，采用全质粒定点突变的方法，分别以克隆成功的质粒CIp10-GF本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种白色念珠菌的研究方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：采用PCR技术获得白色念珠菌的Iqg1p目的蛋白，以所述Iqg1p蛋白为研究对象；采用基因敲除技术和荧光定位技术对所述Iqg1p蛋白的CH、IQ、GAP及GAPC功能区段逐一敲除，筛选出对细胞形态具有重要意义的Iqg1p的IQ模体、GAP、GAPC三个功能区段；构建所述IQ模体、GAP、GAPC三个功能区段的体外表达质粒，获得各自空间结构；采用不同诱导培养基对区段敲除后的菌株菌丝进行诱导培养，获得各区段敲除后的菌株形成菌丝的最佳诱导培养基；采用Western‑Blot检测所述Iqg1p的GAP功能区段与Cdc42p及Rho1p在体外的相互作用，获得Iqg1p蛋白在白色念珠菌中的细胞生物学特性。

【技术特征摘要】
1.一种白色念珠菌的研究方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：采用PCR技术获得白色念珠菌的Iqg1p目的蛋白，以所述Iqg1p蛋白为研究对象；采用基因敲除技术和荧光定位技术对所述Iqg1p蛋白的CH、IQ、GAP及GAPC功能区段逐一敲除，筛选出对细胞形态具有重要意义的Iqg1p的IQ模体、GAP、GAPC三个功能区段；构建所述IQ模体、GAP、GAPC三个功能区段的体外表达质粒，获得各自空间结构；采用不同诱导培养基对区段敲除后的菌株菌丝进行诱导培养，获得各区段敲除后的菌株形成菌丝的最佳诱导培养基；采用Western-Blot检测所述Iqg1p的GAP功能区段与Cdc42p及Rho1p在体外的相互作用，获得Iqg1p蛋白在白色念珠菌中的细胞生物学特性。2.如权利要求1所述的一种白色念珠菌的研究方法，其特征在于，所述诱导培养基为液体培养基和固体培养基；所述液体培养基为LB培养基、SOC培养基、Amp/Kan抗性培养基、YPD培养基、GMM培养基或Mal培养基；所述固体培养基为LB培养基、LB+Amp培养基、LB+Kan培养基、YPD培养基、GMM培养基、Mal培养基、YPD+10％牛血清培养基或Spider培养基。3.如权利要求2所述的一种白色念珠菌的研究方法，其特征在于，所述LB培养基的配方：10gTryptone，5gYeastExtract，10gNaCl，加dH2O定容至1L，121℃灭菌20min；所述Amp/Kan抗性培养基的配方：在100mLLB液体培养基中加入100μL100mg/mLAmp或100mg/mLKan1；所述SOC培养基的配方：除含有20mmol/L葡萄糖外，其他成分与SOB培养基相同；20gTryptone，5gYeastExtract，0.5gNaCl，混匀使溶质充分溶解，加10mL250mmol/LKCl溶液，调pH为7.0，加dH2O定容至1L，121℃灭菌20min；溶液在使用前，加入5mL灭菌的2mol/LMgCl2，高温高压灭菌后的SOB培养基冷却至50℃左右，加20mL过滤除菌的1mol/L葡萄糖溶液，即为SOC培养基；所述YPD培养基的配方：20gPeptone，10gYeastExtract，20g葡萄糖，加dH2O定容至1L，115℃灭菌30min；所述10xGMM培养基的配方：200g葡萄糖，67gYeastNitrogenBasewithoutAminoAcids，加dH2O定容至1L，搅拌均匀，待其充分溶解，用0.22μm的滤膜过滤除菌，使用时稀释10倍即可；所述10xMal培养基的配方：200g麦芽糖，67gYeastNitrogenBasewithoutAminoAcids，加dH2O定容至1L，搅拌均匀，待其充分溶解，用0.22μm的滤膜过滤除菌，使用时稀释10倍即可；所述LB培养基、Amp/Kan抗性培养基、YPD培养基、GMM培养基、Mal培养基在液体培养基的基础上加入2％的琼脂粉即为固体培养基；所述YPD+10％牛血清固体培养基的配方：将高温高压灭菌后YPD固体培养基(90mL)冷却至50℃左右，加入10ml过滤除菌的胎牛牛血清蛋白，混匀后倒平板，每个平板约20mL左右；所述Spider培养基的配方：10g营养肉汤，10g甘露醇，2gK2HPO4，20g琼脂粉，调pH为6.8，加dH2O定容至1L，115℃灭菌30min。4.如权利要求1所述的一种白色念珠菌的研究方法，其特征在于，所述采用PCR技术获得白色念珠菌的目的蛋白的具体过程包括：以提取的白色念珠菌基因组DNA为模板，利用上下游引物进行PCR扩增以获得目的片段；采用一步双酶法对所述目的基因和载体进行双酶切并进行酶连反应，获得连接产物，所述目的基因与所述载体的摩尔比为1-5∶1；转化所述连接产物，获得菌液；采用PCR鉴定所述菌液；筛选阳性克隆质粒后，抽提质粒，对质粒进行酶切验证，测序，将序列完整正确的重组质粒转入大肠杆菌表达型菌株Rosetta中，构建MBP-IQ、M...

【专利技术属性】
技术研发人员：李长润，曾雪，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34