一种双特异性抗体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种双特异性抗体及其制备方法与应用。本发明专利技术的双特异性抗体包括单克隆抗体单元和单链抗体单元；其中，单克隆抗体单元为2个完整的轻链‑重链对，特异性结合肿瘤细胞表面抗原；单链抗体单元包括2个单链抗体，单链抗体包括重链可变区和轻链可变区，特异性结合免疫细胞表面抗原；本发明专利技术提供的双特异性抗体为通过如下任意一种方式连接而成的对称结构：(1)2个单链抗体的C端分别通过连接肽与单克隆抗体的2条重链的N端连接；(2)2个单链抗体的N端分别通过连接肽与单克隆抗体的2条重链的C端连接。本发明专利技术的双特异性抗体能够同时结合免疫细胞和肿瘤细胞，介导导向性免疫反应，有效杀伤肿瘤细胞。

A Bispecific Antibody and Its Preparation and Application

The invention relates to a bispecific antibody, a preparation method and application thereof. The bispecific antibody of the invention includes monoclonal antibody unit and single chain antibody unit, in which the monoclonal antibody unit is two complete light chain heavy chain pairs, specifically binding to the surface antigen of tumor cells; the single chain antibody unit includes two single chain antibodies, and the single chain antibody includes heavy chain variable region and light chain variable region, specifically binding to the surface antigen of immune cells; The bispecific antibodies are symmetrical structures linked by either of the following ways: (1) the C-terminal of two single-chain antibodies is connected to the N-terminal of two heavy chains of monoclonal antibodies by connecting peptides, respectively; (2) the N-terminal of two single-chain antibodies is connected to the C-terminal of two heavy chains of monoclonal antibodies by connecting peptides, respectively. The bispecific antibody of the invention can combine both immune cells and tumor cells, mediate the directed immune response and effectively kill tumor cells.

【技术实现步骤摘要】
一种双特异性抗体及其制备方法与应用
本专利技术涉及生物技术及免疫学
，具体涉及一种结合CD19和CD3的双特异性抗体及其制备方法与应用。
技术介绍
抗体药物是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的生物大分子药物，具有特异性高、性质均一、可针对特定靶点定向制备等优点。单克隆抗体在临床上主要应用于以下三个方面：肿瘤治疗、免疫性疾病治疗以及抗感染治疗。其中，肿瘤治疗是目前单克隆抗体应用最为广泛的领域，目前已经进入临床试验和上市的单克隆抗体产品中，用于肿瘤治疗的产品数量占比大概为50％。单克隆抗体治疗肿瘤是一种针对病变细胞特异靶点刺激免疫系统杀伤靶细胞的免疫疗法，为了增强抗体的效应功能，特别是杀伤肿瘤细胞的效果，人们尝试多种方法改造抗体分子，双特异性抗体是改善抗体治疗效果的发展方向之一，现已成为抗体工程研究领域的热点。双特异性抗体(bispecificantibody，BsAb)是含有两种能够特异性识别并结合不同抗原或不同抗原位点的人工抗体。如果这两种抗原位于不同的细胞表面，则这种双特异性抗体能在这两种抗原分子之间架起桥梁，从而形成细胞之间的交联，介导细胞产生导向性的效应功能。BsAb在生物医学、特别是在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。用于免疫治疗的双特异性抗体(免疫双抗)是含有2种特异性细胞受体抗原结合位点的人工抗体，能在病变细胞(靶细胞)和功能细胞(免疫细胞)之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应。通过BsAb介导免疫细胞(如T细胞，NK细胞等)杀死肿瘤细胞是目前免疫治疗应用研究的热点，其作用机理是BsAb能同时结合肿瘤相关抗原和免疫效应细胞上的靶分子，在活化免疫细胞的同时，直接导向免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。双特异性抗体可通过多种途径获得，其制备方法主要有：化学偶联法、杂交-杂交瘤法和基因工程抗体制备法。化学偶联法是将2个不同的单克隆抗体用化学偶联的方式连接在一起，制备的双特异性单克隆抗体，这是最早的双特异性单克隆抗体。杂交-杂交瘤法是通过细胞杂交法或者三元杂交瘤的方式产生双特异性单克隆抗体，这些细胞杂交瘤或者三元杂交瘤是通过建成的杂交瘤融合，或者建立的杂交瘤和从小鼠的淋巴细胞融合而得到的，只能用于生产鼠源的双特异性抗体，因此，其应用受到了极大的限制。而随着分子生物学技术的迅速发展，出现了基因工程人源化或全人源的双特异性抗体的多种构建模式，主要包括双特异性微抗体、双链抗体、单链双价抗体、多价双特异性抗体四类。目前，国际上已有数种基因工程双特异性抗体药物进入临床试验阶段，并显示有较好的应用前景。T细胞表面的CD3分子由4个亚基组成：δ、ε、γ、ζ，其分子质量分别为18.9kDa，23.1kDa，20.5kDa和18.7kDa，其长度分别为171、207、182、164个氨基酸残基。它们一起组成6条肽链，常与T细胞受体(Tcellreceptor，TCR)紧密结合形成含有8条肽链的TCR-CD3复合体，其结构示意图见图1。该复合体具有T细胞活化、信号转导以及稳定TCR结构的功能。CD3胞质段含有免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif，ITAM)，TCR识别并结合由MHC(majorhisto-compatibilitycomplex)分子提呈的抗原肽，导致CD3的ITAM的保守序列中的酪氨酸残基被T细胞内的酪氨酸蛋白激酶p56lck磷酸化，然后募集其它含有SH2(Scrhomology2)结构域的酪氨酸蛋白激酶(如ZAP-70)。ITAM的磷酸化以及与ZAP-70的结合是T细胞活化信号传导过程早期阶段的重要生化反应之一。因此，CD3分子的功能是转导TCR识别抗原所产生的活化信号。CD19又名B4或Leu-12，属于免疫球蛋白(Ig)超家族成员，其分子量为95kDa，位于16号染色体的短臂上，含有15个外显子，编码556个氨基酸的I型跨膜糖蛋白，免疫球蛋白基因重组时，其最早在晚期祖B细胞和早期前B细胞中表达。CD19在整个B细胞的发育和成熟过程中均高表达，直至B细胞分化为浆细胞时，表达量下调，其在成熟B细胞中的表达是未成熟细胞的3倍。CD19通过同时调节B细胞受体(Bcellreceptor，BCR)依赖和非依赖信号建立B细胞信号阈值，对B细胞的发育、增殖和分化起着重要的调控作用。CD19作为成熟B细胞的表面多分子复合物的主要组成部分，与受体CD21(CD2)，CD81(TAPA-1)以及CD225共同形成复合体，通过调节内源性和受体诱导信号减少触发B细胞分裂及分化所需抗原浓度的阈值。CD81作为伴侣蛋白，提供信号传导途径的分子对接位点，并且调节CD19的表达。CD19通过招募和放大Src家族蛋白酪氨酸激酶的活化，使蛋白酪氨酸激酶(PTK)激活，激活BCR信号。同时当BCR信号激活时，CD19也可通过活化PI3K和下游的Akt激酶，增强BCR信号，促进B细胞的增殖。CD19在正常及恶性B淋巴细胞中均有表达，被视为B细胞发育过程中一个涵盖阶段较长的最为可靠的表面标记物之一。在正常淋巴组织中，CD19在前B细胞、B细胞和滤泡树突状细胞、套细胞、滤泡间T细胞区的树突状大细胞中表达。此外，通过流式细胞学方法检测，CD19在人体组织分离得到的浆细胞中可以检测到。通常来说，CD19在B淋巴细胞瘤中表达，其中包括B淋巴细胞淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、边缘区淋巴。因此，CD19成为B细胞恶性肿瘤治疗的特异性分子靶点。近年来，靶向CD19的免疫治疗策略在临床前以及临床研究中广泛发展，包括单克隆抗体、双特异性抗体和嵌合抗原受体修饰T细胞(CAR-T)，并取得了显著优于常规小分子化疗方案的临床效果，推动了免疫治疗的进展。肿瘤的过继免疫治疗是将自体或异体的免疫活性细胞经过体外扩增后输入患者体内，直接杀伤肿瘤细胞，调节和增强机体的免疫功能，主要包括LAK细胞、TIL细胞、激活的T淋巴细胞和CIK细胞的免疫治疗。而免疫疗法只能清除少量的、零散的肿瘤细胞，对于晚期的实体肿瘤疗效有限。故常将其作为一种辅助疗法与手术、化疗、放疗等常规方法联合应用：先用常规方法清扫大量的肿瘤细胞后，再用免疫疗法清除残存的肿瘤细胞，可提高肿瘤综合治疗的效果。过继免疫治疗作为肿瘤综合治疗中的一个新方法，已经与常规手术治疗、放疗、化疗及其他细胞和分子治疗广泛配合，在多种肿瘤的治疗中具有广泛的应用前景。然而，结合双特异性抗体，理想的肿瘤过继免疫治疗应为：双特异性抗体的一端结合免疫细胞的表面抗原(如CD3)，并随之一起输入体内，而双特异性抗体的另一端则能够很好地结合肿瘤细胞的表面抗原；这样，双特异性抗体就能在体内架起肿瘤细胞和免疫细胞之间的桥梁，使免疫细胞集中在肿瘤细胞周围，进而杀伤肿瘤细胞。通过这种方法可有效解决肿瘤细胞的转移和扩散，克服了手术、放化疗三大传统治疗方式后的“不彻底、易转移、副作用大”等弊端。因此，开发高效的、结合肿瘤细胞和免疫细胞的双特异性抗体具有重要意义。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的技术问题，本专利技术的目的在于提供一种结合CD19和CD3、具有特异的靶向作用、能够高效激发导向性免疫反应的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种结合CD19和CD3的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包括(a)单克隆抗体单元和(b)单链抗体单元；所述单克隆抗体单元为2个完整的轻链‑重链对，能够特异性结合CD19；所述单链抗体单元包括2个单链抗体；所述单链抗体包括重链可变区和轻链可变区，能够特异性结合CD3；所述双特异性抗体为通过如下任意一种方式连接而成的对称结构：(1)所述2个单链抗体的C端分别通过连接肽与所述单克隆抗体的2条重链的N端连接；(2)所述2个单链抗体的N端分别通过连接肽与所述单克隆抗体的2条重链的C端连接。

【技术特征摘要】
1.一种结合CD19和CD3的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包括(a)单克隆抗体单元和(b)单链抗体单元；所述单克隆抗体单元为2个完整的轻链-重链对，能够特异性结合CD19；所述单链抗体单元包括2个单链抗体；所述单链抗体包括重链可变区和轻链可变区，能够特异性结合CD3；所述双特异性抗体为通过如下任意一种方式连接而成的对称结构：(1)所述2个单链抗体的C端分别通过连接肽与所述单克隆抗体的2条重链的N端连接；(2)所述2个单链抗体的N端分别通过连接肽与所述单克隆抗体的2条重链的C端连接。2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述连接肽的氨基酸序列为(GGGGX)n，其中，X为Gly或Ser，n为1-4的自然数；优选地，所述连接肽的氨基酸序列如SEQIDNO.13所示。3.根据权利要求1或2所述的双特异性抗体，其特征在于，所述单链抗体的轻链序列如SEQIDNO.5所示或如SEQIDNO.9所示；所述单链抗体的重链序列如SEQIDNO.6所示或如SEQIDNO.10所示；优选地，所述单链抗体的轻链和重链组成融合肽，所述融合肽的序列为如下任意一种：(1)当所述2个单链抗体的C端分别通过连接肽与所述单克隆抗体的2条重链的N端连接时，所述融合肽的序列如SEQIDNO.16所示。(2)当所述2个单链抗体的N端分别通过连接肽与所述单克隆抗体的2条重链的C端连接时，所述融合肽的序列如SEQIDNO.17所示。4.根据权利要求3所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体为鼠源抗体、人源化抗体、嵌合抗体或重组抗体。5.根据权利要求3或4所述的双特异性抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的轻链和重链通过二硫键连接；所述单克隆抗体的Fc片段为人或人源化抗体的Fc片段，所述人或人源化抗体为IgG1、IgG2、IgG3或...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁清安，孟庆武，白丽莉，赵立坤，李延虎，
申请(专利权)人：益科思特北京医药科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11