一种靶向CD24且激活NK细胞的双特异性抗体的制备及其应用制造技术

本发明专利技术属基因工程抗体技术领域，具体涉及一种靶向CD24且激活NK细胞的双特异性抗体的制备及其应用。本发明专利技术利用基因工程技术将抗CD24人源化嵌合抗体cG7与具有募集和激活NK细胞活性的MICA分子通过柔性肽(Gly4Ser)连接，稳转于CHO‑s真核表达体系，挑取稳定高表达细胞株扩大培养表达cG7‑MICA；双特异性抗体cG7‑MICA利用cG7的靶向作用可以重塑MICA的功能将MICA选择性地展示在CD24

Preparation and Application of a Bispecific Antibody Targeting CD24 and Activating NK Cells

The invention belongs to the technical field of genetic engineering antibody, in particular to the preparation and application of a bispecific antibody targeting CD24 and activating NK cells. The invention utilizes genetic engineering technology to connect anti-CD24 humanized chimeric antibody cG7 with MICA molecule which has the activity of recruiting and activating NK cells through flexible peptide (Gly4Ser), stably transfers to CHO_s eukaryotic expression system, picks stable high-expression cell lines and enlarges the expression of cG7_MICA; Bispecific antibody cG7_MICA can selectively display MICA by using the targeting effect of cG7. Shown in CD24

【技术实现步骤摘要】
一种靶向CD24且激活NK细胞的双特异性抗体的制备及其应用
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种新的可同时与白细胞分化抗原CD24(clusterofdifferentiation24)和自然杀伤细胞(naturalkillercells；NKcells)表面上活化型受体NKG2D(NKcellreceptorNKgroup2，memberD)特异性结合的抗CD24人源化嵌合抗体融合人源MICA分子的双特异性抗体cG7-MICA，其利用cG7的靶向作用可以重塑MICA的功能将MICA选择性地展示在肝癌细胞表面，募集并激活NK细胞发挥抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用(Antibody-DependentCell-mediatedCytotoxicity；ADCC)。在CD24+人源肝癌细胞Huh-7皮下荷瘤小鼠模型中，可有效抑制肿瘤组织的生长。cG7-MICA的设计可以避免肿瘤组织中MICA分子的脱落导致的肿瘤免疫逃逸，并且具备Fc段引导的ADCC作用，是一种具有靶向CD24分子和增强NK细胞功能的双特异性基因工程抗体。
技术介绍
肿瘤的治疗一直是我们面对的棘手的难题，由于化疗和手术治疗对机体损伤大、预后差，肿瘤免疫疗法成为当代肿瘤治疗的热点。肿瘤免疫治疗旨在重塑机体自身免疫系统对肿瘤细胞的识别与杀伤能力，利用抗体与抗原或者配体与受体的特异性结合的导向性将机体天然存在的免疫细胞募集到肿瘤病灶部位，利用免疫细胞发挥杀伤肿瘤细胞的活性。因此，寻找有效的分子靶标将为实现特异性的肿瘤免疫治疗提供可能性。(一)肝癌与肿瘤相关性抗原CD24分子。肝癌(Hepatocellularcarcinoma；HCC)是最普遍的原发性肿瘤，并影响着世界上许多人的健康。它被列为全球第五大常见的癌症并成为第二大导致癌症死亡的原因。HCC相对于其他人类实体恶性肿瘤具有高侵袭性和转移力的特点，因此给肝癌的治疗增加了难度。在治疗肝癌上已经投入了很多的努力，但都由于一些不良反应，许多用于治疗晚期HCC的临床药物已被放弃。单一治疗药物，而包括贝伐单抗(Avastin)和西妥昔单抗(Cetuximab)在内的治疗性抗体也都显示出有限的抗HCC活性。肿瘤相关性抗原CD24分子是一种高度糖基化的膜蛋白，在多种肿瘤细胞上表达，CD24在原发性肝癌组织中有高表达概率。并且在原发性肝癌组织中CD24的表达显著高于肿瘤临近组织和正常的肝组织。在肿瘤细胞中，CD24通过糖基磷脂酰肌醇锚定于细胞膜上的脂筏结构。该结构是Src家族酪氨酸激酶信号途径的重要平台。CD24与Src相互作用并增强Src激酶活性，进而使STAT3分子(signaltransducersandactivatorsoftranscription)形成活化态；活化的STAT3形成二聚体进入细胞核内，发挥转录因子的作用。说明CD24的表达与肿瘤细胞的分化、侵袭、转移和肿瘤的复发等密切相关。这些都显示CD24分子可以作为肿瘤细胞的特异性标记分子，可以用作为肝癌治疗的分子靶标。(二)肿瘤免疫逃逸与MICA/NKG2D信号通路。人体中免疫系统重要的一部分即为免疫监视，免疫监视的重要机制之一是肿瘤细胞表面的MHC-I类链分子(MICA/B,majorhistocompatibilitycomplexclassIchain-relatedgeneA/B)的高表达，多种肿瘤细胞上都会表达MICA/B分子。MICA/B是NK细胞和CD8+T细胞表面活化型受体NKG2D的配体，NK细胞或CD8+T细胞通过NKG2D(NKcellreceptorNKgroup2,memberD)与MICA/B的相互作用，进而靠近肿瘤细胞并与之结合，释放出穿孔素-颗粒酶，分泌IFN-γ、TNF-α等多种细胞因子诱导肿瘤细胞的溶解。MICA是一种高度糖基化的蛋白质分子，属于非经典HLA-I(humanleucocyteantigen-I)类基因家族。其结构与经典HLA-I类分子相似，包括3个胞外结构域：α1、α2和α3，跨膜区和胞内区。α1、α2区域则决定MICA与NKG2D受体的相互作用。但研究表明，在肿瘤的生长进程中，MICA分子会受蛋白水解酶作用而脱落，导致肿瘤组织虽然仍属于MICA阳性，但却能避开免疫监视并发生免疫逃逸。因此，寻找一种重塑肿瘤细胞表面MICA分子功能，避免其脱落带来的弊端的方法将成为肿瘤免疫治疗的新途径。(三)基因工程抗体。抗体药物在抗肿瘤领域的应用目前受到多领域科研工作者的青睐，以其高靶向性和特异性的优点而成为研究的热潮，据统计，目前FDA批准的抗体类药物主要用于治疗癌症、自身免疫病、血液紊乱以及病毒感染等疾病。抗体药物在抗肿瘤领域正处于高速发展阶段。抗体药物与化(放)疗法及手术治疗方法的联用，能够有效减少毒副作用，提高治疗效率，应用前景广阔。抗体类型包括双特异性抗体、单链抗体、纳米抗体、嵌合抗体、人源化抗体等，各自实现着不同的功能，可根据自己的需要在基因水平进行改造。而用于治疗人身体疾病的抗体必须是人源的抗体，现生产抗体的技术也日渐成熟，目前可利用噬菌体库筛选出人源的抗体，或者利用杂交瘤技术生产出鼠源的抗体再进行人源化改造。随着细胞培养水平的提高，抗体小规模的构建、表达、纯化成为可能。基于上述理论基础与科研实践，本专利技术在实验室自主开发的鼠源抗CD24单链融合MICA抗体rG7s-MICA的基础上进行基因改造构成人源化嵌合抗体cG7，进一步在其Fc段C端与人源MICA胞外1-3区通过柔性肽(Gly-Gly-Gly-Ser)连接，设计一种新型双特异性抗体cG7-MICA。cG7-MICA的设计将cG7作为有效载体，有选择性地把MICA带到肝癌细胞的表面，MICA分子与NK细胞表面的活化型受体NKG2D结合，激活NK细胞，重塑MICA的功能。并且cG7-MICA可通过其融合的Fc段与NK细胞表面的Fc受体结合，进一步激活NK细胞。活化后的NK细胞发挥ADCC作用，释放穿孔素和颗粒酶，同时分泌细胞因子IFN-γ和TNF-α发挥杀伤肝癌细胞活性。因此，具有自主知识产权的双特异性抗体cG7-MICA的开发，有效激活在免疫监视系统中发挥重要作用的NK细胞，为肿瘤免疫治疗体系提供可能的临床用药方案。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术提供一种具有肿瘤免疫疗效的靶向CD24的双特异性抗体。技术方案：一种靶向CD24且激活NK细胞的双特异性抗体，该双特异性抗体以抗CD24人源化嵌合抗体cG7与具有激活NK细胞活性的人源MICA分子为基础，运用基因重组手段，利用柔性肽(Gly4Ser)将两段蛋白连接起来构建成cG7-MICA。该抗体的重链的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述抗体的重链的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；该抗体的轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，所述抗体的轻链的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术中的双特异性抗体可同时与白细胞分化抗原CD24和NK细胞活化型受体NKG2D特异性结合的抗CD24人源化嵌合抗体融合人源MICA分子的双特异性抗体cG7-MICA，其利用cG7的靶向作用可以重塑MICA的功能将MICA选择性地展示在肝癌细胞表面，募集并激活NK细胞发挥抗体依赖性的细胞介导的细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向CD24且激活NK细胞的双特异性抗体，其特征在于，该抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种靶向CD24且激活NK细胞的双特异性抗体，其特征在于，该抗体的重链的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的靶向CD24且激活NK细胞的双特异性抗体，其特征在于，该抗体的轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。3.根据权利要求1所述的靶向CD24且激活NK细胞的双特异性抗体，其特征在于，所述抗体的重链的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。4.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：张娟，王旻，韩月，孙福谋，王阳，王斐，蔡佳玲，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32