穿过血脑屏障的人源化抗体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及通过将现有抗体人源化衍生的抗体及其片段以及制备它们的方法。相对于亲本非人源化的抗体，本发明专利技术的人源化抗体表现出与脑内皮抗原的结合得到增强、穿过血脑屏障得到改善和热稳定性得到增加。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】穿过血脑屏障的人源化抗体及其用途相关申请的交叉引用本申请要求于2017年7月6日提交的美国临时专利申请号62/358,777的利益，其内容通过引用结合在本文中。专利
本专利技术涉及穿过血脑屏障的人源化抗体及其片段及其用途。更具体地，本专利技术涉及通过将现有抗体人源化衍生的抗体及其片段。本专利技术的抗体表现出与脑内皮抗原的结合得到增强和穿过血脑屏障得到改善。专利技术背景神经变性疾病，诸如阿尔茨海默病和帕金森病，由于目前尚没有对这些致残性病况的有效的治疗，日益成为我们老龄化社会的负担。由于大部分适当的治疗剂分子和诊断剂不能穿过紧密且高度限制性的血脑屏障(blood-brainbarrier，BBB)(Abbott,2013)，因此，起源于脑的这些和其他疾病的治疗以及早期诊断仍然是具有挑战性的。BBB组成由内衬血管并且彼此通过紧密连接而联结的脑内皮细胞(brainendothelialcell，BEC)形成的物理屏障(Abbott,2013)。BEC之间形成的紧密连接是BBB的完整性必需的，并且防止大于500道尔顿(Da)的亲水分子的细胞旁转运。由于脑内皮细胞表现出非常低的胞饮率(Abbott,2013)，因此较大分子的跨细胞转运局限于高度特异性的受体介导的胞吞转运(receptormediatedtranscytosis，RMT)途径和被动的基于电荷的吸附介导的胞吞转运作用(Abbott，2013；Pardridge，2002)。另外，高密度流出泵，如P-糖蛋白或多药耐药蛋白1(MDR-1)，有助于从脑去除不需要的物质(Abbott，2013)。尽管所有这些特征保护脑免受病原体和毒素，它们同样防止大部分治疗剂的进入。事实上，少于5％的小分子治疗剂和几乎没有较大的治疗剂能够以药理学相关的浓度(即，足以结合中枢神经系统(centralnervoussystem，CNS)靶标并引发药理学/治疗性反应)穿过BBB，除非它们被特异性‘摆渡’，即，偶联到转运分子上。由于缺少将分子转运穿过BBB的有效‘运载体’，许多针对神经变性疾病的药物由于不能以有效量递送到脑中而已经被从进一步的研发中‘搁置’或排除。已经探索了将较大分子递送到脑中的不同方法。例如，可以破坏BBB的完整性，导致渗漏的BBB，其进而允许较大分子非限制性、细胞旁进入脑中。紧密连接能够通过各种方法成功地变松或破坏。例如，注射诱导到血流中的渗透休克的物质(例如，甘露醇、高渗溶液)引起细胞收缩并且导致紧密连接被破坏，因此严重地损害BBB(Guillaume，2010)。紧密连接的其他调节剂包括烷基甘油、缓激肽及其几种类似物以及调节参与维持紧密连接的蛋白的表达的病毒(Erdlenbruch等人，2003；Preston等人，2008；Gan等人，2013)。通过应用超声，更加局部化的BBB破坏是可能的(Nhan等人，2013)。然而，BBB被破坏的期间足以改变脑内稳态并且允许有害的化学品、毒素和病原体进入脑；这能够导致严重的副作用，例如，癫痫发作和脑肿胀、感染和可能的永久性神经病变。因此，对于影响多个脑区的慢性和弥散性脑病使用这些技术进行重复治疗不可行。这些治疗中的大部分是昂贵的、必须住院，并且一些方法需要麻醉。另一种绕过BBB的方法是将治疗分子直接注射到脑脊液(cerebrospinalfluid，CSF)、实质空间或脑的其他部分。已经开发了一些递送方法，包括：通过输注或对流增强扩散(convection-enhanceddiffusion，CED)泵进行的大脑内(实质内)、脑室内和鞘内递送。然而，向脑内的任何类型的直接注射或大脑内植入物是侵入性的且花费高的过程，原因在于其需要住院、麻醉以及通常需要手术。此外，治疗剂(特别是大的生物制剂)在脑实质内的差的扩散速率限制治疗剂仅透到注射/植入位点周围的小区域。注射剂、导管和植入物的正确放置对于实现药物向脑的靶向区域的扩散是具有挑战性又至关重要的。另外，导管和植入物提供了感染的部位和/或针对外来物质的免疫应答。在另一个增加穿过BBB的递送的尝试中，已对CNS药物进行修饰以增加其脑摄入。此类修饰能够包括改变其表面电荷、减小分子尺寸和改变药物的亲脂性。然而，任意增加脑透过的修饰也很可能改变药物的整体药理学，包括其期望的活性和/或特异性。另外，亲脂性分子更倾向于透过P-糖蛋白流出泵被从脑中排出。最后，已经开发利用了穿过BBB的内源性转运机制。允许大分子穿过BBB转运的生理机制能够分为高特异性受体介导的胞吞转运(RMT)和非特异性的基于电荷的吸附介导的胞吞途径。当特异性配体与其受体结合时，或当阳离子配体或药物与脑内皮细胞表面(腔侧)上的阴离子官能团静电相互作用时，分别引发胞吞作用。随之，新形成的内体被胞吞转运穿过细胞进入远腔侧，从而释放其货物。由于吸附介导的胞吞转运作用是非特异性的、电荷介导的相互作用，其在所有血管床和器官中发生，这限制了药物对脑递送的可用性。因此，利用RMT途径仍然是唯一生理学的、非侵入性而高度受体特异性脑递送方法。目前仅已知少量的受体在BBB处进行RMT并且“摆渡”穿过其天然配体：充分研究过的运铁蛋白受体(transferrinreceptor，TfR)、胰岛素受体(insulinreceptor，IR)、低密度脂蛋白受体相关蛋白1和2(low-densitylipoproteinreceptorrelatedprotein1and2，LRP-1和-2)和白喉毒素受体。已经开发了结合这些受体的肽、天然配体和抗体或抗体片段(Pardridge等人，1991；Yu等人，2011；Muruganandam等人，2001；Abulrob等人，2005；Demeule，2008；Sumbria等人，2013)，它们作用为利用内源性RMT途径的药物-到-脑的转运体。最近，已经证明针对CD98hc(大的中性氨基酸转运蛋白的成分)的抗体进行穿过BBB的胞吞转运作用(Zuchero等人，2016)，这表明这种转运蛋白可能是用于开发BBB运载体的另一个靶标。然而，迄今为止，在II期临床研究中仅已经分析了单种肽(AngiopepANG1005，靶向LRP-1)，而其他的候选物正在实验室环境中或刚进入1期研究进行研究。RMT途径似乎是将生物药物转运到脑中的最有希望的途径，但是目前的方法具有局限性，包括靶标受体在BBB的非选择性表达，在运载体与受体的天然配体之间的竞争，无效的受体胞吞转运作用，以及被胞吞的运载体的溶酶体降解(Xiao和Gun，2013)。不破坏BBB的生理学和稳态的高容量和高选择性BBB运载体的缺乏延缓了用于起源于脑的疾病(包括脑瘤和神经变性疾病)的新治疗剂和诊断剂的开发。专利技术概述本专利技术涉及穿过血脑屏障的抗体及其片段以及它们的用途。更具体地，本专利技术涉及通过将已有的抗体人源化衍生的抗体及其片段，本专利技术的抗体表现出增强的与脑内皮抗原的结合和穿过血脑屏障得到改善。本专利技术提供包含下述序列的分离的或纯化的抗体或其片段：X1VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWX2RQAPGKX3X4EX5VSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNSKNTX6YLQMNSLRAEDTAVYYCAAG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的或纯化的抗体或其片段，其包含下述序列：X1VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWX2RQ APGKX3X4EX5VSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNSKNTX6YLQ MNSLRAEDTAVYYCAAGSTSTATPLRVDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:9)，其中X1＝D或E，X2＝F或V，X3＝E或G，X4＝R或L，X5＝F或W，X6＝L或V。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.07.06 US 62/358,7771.一种分离的或纯化的抗体或其片段，其包含下述序列：X1VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWX2RQAPGKX3X4EX5VSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNSKNTX6YLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSTSTATPLRVDYWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:9)，其中X1＝D或E，X2＝F或V，X3＝E或G，X4＝R或L，X5＝F或W，X6＝L或V。2.权利要求1所述的分离的或纯化的抗体或其片段，其中所述序列选自SEQIDNO:2至8中的任一种。3.权利要求1或2所述的分离的或纯化的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段以多价展示形式存在。4.权利要求3所述的分离的或纯化的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段连接到Fc片段上。5.权利要求4所述的分离的或纯化的抗体或其片段，其中所述Fc片段是小鼠Fc2b或人Fc1。6.权利要求5所述的分离的或纯化的抗体或其片段，其中所述Fc包含SEQIDNO:20的序列。7.权利要求1-6中任一项所述的分离的或纯化...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·斯坦尼米洛维克，K·凯默里奇，Y·杜罗切尔，T·苏利，
申请(专利权)人：加拿大国家研究委员会，
类型：发明
国别省市：加拿大,CA