一种可靶向CTLA4和PD-1的单基因双特异性抗体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种可靶向CTLA4和PD‑1的单基因双特异性抗体，从N端到C端依次包括第一靶点结合区、第二靶点结合区和Fc区，第一靶点结合区与第二靶点结合区通过连接片段连接，第一靶点结合区靶向CTLA4和PD‑1中的一个，第二靶点结合区靶向另一个；还涉及单基因双特异性抗体在制备用于抗肿瘤药物中的应用；还涉及一种AAV双特异性抗体表达载体。本发明专利技术的单基因双特异性抗体可有效地靶向PD1和CTLA4，并且该抗体序列短，结构简单，适合用于构建基于AAV病毒的抗体表达载体，所得到的抗体表达载体可用于直接注射，并且提高了抗体在体内的维持时间。

A single gene bispecific antibody targeting CTLA4 and PD-1 and its application

The present invention relates to a single gene bispecific antibody targeting CTLA4 and PD1, which includes the first target binding region, the second target binding region and the Fc region from N to C ends in turn. The first target binding region and the second target binding region are connected by connecting fragments. The first target binding region targets one of CTLA4 and PD1, and the second target binding region targets another. The application of specific antibodies in the preparation of antineoplastic drugs and the expression vector of AAV bispecific antibodies are also involved. The single gene bispecific antibody of the invention can effectively target PD1 and CTLA4, and the antibody sequence is short, the structure is simple, and it is suitable for constructing the antibody expression vector based on AV virus. The obtained antibody expression vector can be used for direct injection, and the maintenance time of the antibody in vivo is improved.

【技术实现步骤摘要】
一种可靶向CTLA4和PD-1的单基因双特异性抗体及其应用
本专利技术涉及肿瘤治疗药物领域，更特别地，涉及一种可靶向CTLA4和PD-1的单基因双特异性抗体及其应用，以及包含上述单基因双特异性抗体的DNA编码序列的AAV抗体表达载体。优先权本申请要求本申请人于2018年8月9日提交的申请号为201810903651X的专利技术专利申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文中。
技术介绍
双特异性抗体最早出现在20世纪90年代，当时已经有学者开始研究具备两个抗原结合位点的抗体，根据双特异性抗体的结构可以将其分为IgG类亚型和非IgG类亚型两种，各类别下都具有多种不同的形式。其中又以IgG类亚型的三功能抗体(Triomab)和非IgG类亚型的双特异性T细胞衔接器(BispecificTcellEngager，BiTE)技术最为成熟。BiTE主要是通过CD3抗体成为T细胞衔接器，不适合开发针对某些标靶(例如PD1和CTLA4等)的双特异性抗体。并且，目前的双特异性抗体存在结构复杂、效价不高、特异性受影响的缺点。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(cytotoxicTlymphocytesociatedantigen4，CTLA4)是共刺激分子B7的受体，主要表达于被激活T细胞表面。B7结合CTLA4能抑制T细胞的激活，从而抑制免疫系统功能。因此，许多肿瘤疾病，例如一些黑色素瘤、肺癌、前列腺癌和宫颈癌等都与CTLA4的表达有关。针对CTLA4的单抗药已经广泛的运用于治疗黑色素瘤,小细胞肺癌,膀胱癌和前列腺癌等，并显示出一定的疗效。PD-1可下调效应T细胞应答，经由PD-1的抑制性信号转导诱导T细胞的无反应或无应答性状态，从而导致细胞不能克隆性扩增或产生最佳水平的效应细胞因子。PD-1还可通过其抑制来自共刺激的存活信号的能力来诱导T细胞的细胞凋亡。有研究显示，将靶向CTLA4的抗体与靶向PD1的抗体进行组合治疗后，临床疗效提升最高。然而，两种抗体联合治疗导致很高的治疗费用，但是目前本领域尚未构建出效果良好的既抗CTLA4又抗PD-1的双特异性抗体。因此，需要一种新的针对CTLA4和PD-1的双特异性抗体。
技术实现思路
为解决以上问题，本专利技术提供了一种可靶向CTLA4和PD-1的单基因双特异性抗体，从N端到C端依次包括第一靶点结合区、第二靶点结合区和Fc区，所述第一靶点结合区与所述第二靶点结合区通过连接片段连接，所述第一靶点结合区靶向CTLA4和PD-1中的一个，所述第二靶点结合区靶向另一个。在一个优选实施方案中，所述第一或第二靶点结合区的序列如SEQIDNO:1所示，所述第二或第一靶点结合区的序列如SEQIDNO:2所示。在一个优选实施方案中，所述Fc区的序列如SEQIDNO:3所示。在一个具体实施方案中，所述连接片段由一个或多个单元序列构成，所述单元序列如SEQIDNO:4所示。优选地，所述连接片段序列如SEQIDNO:12所示。在一个优选实施方案中，所述单基因双特异性抗体的序列如SEQIDNO:5或6所示。本专利技术还提供了上述单基因双特异性抗体在制备用于抗肿瘤药物中的应用。在一个具体实施方案中，所述抗肿瘤药物用于治疗结肠癌、黑色素瘤、肺癌、前列腺癌、宫颈癌、膀胱癌中的一种或多种。本专利技术还提供了一种AAV双特异性抗体表达载体，其包括上述单基因双特异性抗体的DNA编码序列表达框。优选地，所述第一或第二靶点结合区的DNA编码序列如SEQIDNO:9所示，所述第二或第一靶点结合区的DNA编码序列如SEQIDNO:10所示。所述Fc区的DNA编码序列优选如SEQIDNO:13所示。在一个优选实施中，所述单基因双特异性抗体的DNA编码序列如SEQIDNO:7或8所示。在一个优选实施方案中，单基因双特异性抗体的DNA编码序列的5’端还连接有信号肽编码序列。优选的，所述信号肽的DNA编码序列如SEQIDNO:11所示。本专利技术的单基因双特异性抗体可有效地靶向PD1和CTLA4，并且该抗体序列短，结构简单，适合用于构建基于AAV病毒的抗体表达载体，所得到的抗体表达载体可用于直接注射，并且提高了抗体在体内的维持时间。附图说明图1为本专利技术的单基因双特异性抗体的一级结构示意图；图2为本专利技术的单基因双特异性抗体进行同源二聚化后的结构示意图；图3为ELISA检测得到QV1-6与PD1和CTLA4蛋白的结合力的统计图；图4为QV5和QV6的Western-blot检测照片；图5为不同浓度的QV5和QV6对PD-1的结合力曲线；图6为不同浓度的QV5和QV6对CTLA4的结合力曲线；图7为分别用QV5和QV6处理过的T细胞对靶细胞的特异性裂解率统计图；图8为使用AAV-QV6在人源化小鼠体内治疗HT29结肠癌过程中肿瘤大小的时间曲线；图9为使用AAV-QV6在人源化小鼠体内治疗HT29结肠癌过程中小鼠的存活率时间曲线。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。1.单基因四价双特异性抗体的构建及表达我们在研究过程中获得了三株抗体，其中1株靶向PD-1，另外两株靶向CTLA4。通过对这三株抗体的结构和序列分析，我们设计了一个靶向CTLA4的蛋白质结构域AC(氨基酸序列SEQIDNO:1，核苷酸序列SEQIDNO:9)，和两个靶向PD-1的蛋白结构域分别命名为AP1(序列未给出)和AP2(SEQIDNO:2，核苷酸序列SEQIDNO:10)。将这三个结构域进行组合以linker相连之后，再与IgGFc4恒定区(SEQIDNO:3)连接(如图1所示)，得到六株新抗体，如表1所示。表1六株新抗体的组成抗体QV1QV2QV3QV4QV5QV6组成AC+AP1AP1+ACAP2+AP1AP1+AP2AP2+ACAC+AP2注：以上组成中，写在+左边的位于N端，两个结构域之间以linker(SEQIDNO:12)连接。根据所设计的抗体的序列，我们设计合成了相应的基因编码序列，并在前端加上了信号肽(SEQIDNO:11)，然后将待表达的序列插入到pVAX1载体上形成表达质粒。将上述构建正确的质粒扩增，通过转染试剂PEI转染293F细胞，6天后收集细胞上清进行ProteinG纯化得到相应的抗体，每两个抗体蛋白链之间会通过IgGFc4上的半胱氨酸形成二硫键结合在一起，形成由Y字构型的同源二聚体，从而成为双特异性的四价抗体(图2)。2.有功能的抗体的筛选对以上的纯化得到的抗体QV1-6进行酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunoassay，ELISA)检测抗体对于PD-1和CTLA4的亲和力，以市售的单特异性抗体Yer和Opd作为对照。检测板以0.5μg·ml-1的浓度包被，每孔100ul，4℃孵育过夜后，用4％BSA封闭，每孔200μl，37℃孵育1h，洗涤4次，每孔加入梯度稀释的抗体或者细胞上清100μl，孵育1h，洗涤4次，每孔加入1：1000稀释的HRP标记的二抗100ul，37℃孵育1h，洗涤4次后，加底物，37℃孵育15min，50ul2M的HCL中止反应，测定样品的光密度值(OD450nm)。结果如图3所示，QV5(氨基酸序列SEQIDNO:5，核苷酸编码序列SEQIDNO:本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可靶向CTLA4和PD‑1的单基因双特异性抗体，其特征在于，从N端到C端依次包括第一靶点结合区、第二靶点结合区和Fc区，所述第一靶点结合区与所述第二靶点结合区通过连接片段连接，所述第一靶点结合区靶向CTLA4和PD‑1中的一个，所述第二靶点结合区靶向另一个。

【技术特征摘要】
2018.08.09 CN 201810903651X1.一种可靶向CTLA4和PD-1的单基因双特异性抗体，其特征在于，从N端到C端依次包括第一靶点结合区、第二靶点结合区和Fc区，所述第一靶点结合区与所述第二靶点结合区通过连接片段连接，所述第一靶点结合区靶向CTLA4和PD-1中的一个，所述第二靶点结合区靶向另一个。2.根据权利要求1所述的单基因双特异性抗体，其特征在于，所述第一或第二靶点结合区的序列如SEQIDNO:1所示，所述第二或第一靶点结合区的序列如SEQIDNO:2所示。3.根据权利要1所述的单基因双特异性抗体，其特征在于，所述Fc区的序列如SEQIDNO:3所示。4.根据权利要求1-3中任一项所述的单基因双特异性抗体，其特征在于，所述连接片段由一个或多个单元...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴稚伟，吴喜林，李彦磊，黄碧莲，马晓花，
申请(专利权)人：源道隆苏州医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32