双特异性抗HER2抗体制造技术

人源化双特异性抗HER2抗体，其包含一个含有曲妥珠单抗重链和轻链可变区的抗原结合位点，和另一个含有帕妥珠单抗重链和轻链可变区的抗原结合位点。所述双特异性抗HER2抗体可有效治疗癌症，诸如乳腺癌、胃癌或卵巢癌。优选的双特异性抗HER2抗体是非岩藻糖基化抗体。还提供具有功能失调的Slc35C1基因的中国仓鼠卵巢(CHO)突变细胞系，所述基因是突变体中影响聚糖调节的唯一功能失调基因。

Bispecific anti-HER2 antibody

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】双特异性抗HER2抗体对序列表、表格或计算机程序的引用序列表随同说明书以ASCII格式文本文件经EFS-Web同时提交，文件名为序列表序列表.txt，创建日期为2017年3月13日，大小为30.7千字节。通过EFS-Web提交的序列表是说明书的一部分，并通过引用的方式整体并入本文。
本专利技术涉及肿瘤学治疗和分子免疫学的领域，并涉及一种抗Her2抗体和药物组合物及其用途。具体而言，本专利技术涉及人源化双特异性抗Her2抗体，其包含一个含有曲妥珠单抗重链和轻链可变区的抗原结合位点，和另一个含有帕妥珠单抗重链和轻链可变区的抗原结合位点。本专利技术还涉及具有功能失调的Slc35C1基因的中国仓鼠卵巢(CHO)突变细胞系；该突变细胞系表达岩藻糖基化减少的蛋白质。
技术介绍
人表皮生长因子受体2(缩写为Her2、ERBB2、HER2/neu或c-erbB2)是一种由ERBB2基因编码的蛋白质。在正常细胞中，Her2具有非常低的表达水平；但Her2在胚胎发育期间高度表达，在对细胞增殖、分化、发育、粘附和迁移的调节中非常重要(Gutierrez,C.和R.Schiff,HER2:biology,detection,andclinicalimplications.ArchPatholLabMed,2011.135(1):第55-62页)。Her2属于人表皮生长因子受体家族，该家族由4个成员组成：Her1(EGFR)、Her2、Her3和Her4。Her2没有特异性配体，并且其下游途径的激活依赖于同源或异源二聚体的形成(Gutierrez等人，ArchPatholLabMed,2011.135(1):第55-62页)。人表皮生长因子受体全部位于细胞表面，并且具有相似的结构：一个与配体结合的细胞外结构域(ECD)，一个单次跨膜α-螺旋跨膜结构域和一个由细胞内膜近端结构域、酪氨酸激酶催化结构域和起调节作用的富含酪氨酸的C端尾部结构域组成的细胞内区域(Eccles,IntJDevBiol,2011.55(7-9):第685-96页)。人表皮生长因子受体的细胞外结构域(ECD)可进一步分为4个亚结构域，即I、II、III和IV区，其中II区和IV区是富含半胱氨酸的结构域，参与受体的二聚化和激活。Her2过度表达可能导致细胞正常功能紊乱，并且通常与肿瘤的发生和发展密切相关。Her2的同源或异源聚合可导致受体酪氨酸残基磷酸化，并且引发许多信号途径并引起细胞增殖和肿瘤发生。作为预后和预测的生物标志物，Her2基因的扩增或过度表达在约15-30％的乳腺癌和10-30％的胃癌/食道癌中发生。在其它肿瘤诸如卵巢、子宫内膜、膀胱、肺、结肠和头颈肿瘤中也可观察到Her2过度表达。在乳腺癌中，通常将Her2认为是预测因子和治疗靶标。由于Her2没有特异性配体，其抗体通常通过阻断受体二聚化和激活以及介导免疫系统的杀伤作用来抑制肿瘤细胞。目前，曲妥珠单抗(Trastuzumab)和帕妥珠单抗(Pertuzumab)是市售的主要Her2靶向治疗抗体。1998年，FDA批准了HER2靶向性人源化单克隆抗体，Genentech公司的曲妥珠单抗(也称为人源化程度95％)。这种抗体识别Her2细胞外结构域IV近膜表位，并且其抗原亲和常数可高达0.1nmol/L。曲妥珠单抗识别IV部分的C端处由3个环(557-561、570-573和593-603)组成的表位。因为表位可以靠近其二聚化伴侣的结合结构域或直接与之相互作用，所以曲妥珠单抗与表位的结合可以诱导抑制二聚化过程的空间位阻。另外，曲妥珠单抗的结合还可以保护Her2受体的细胞外结构域免受蛋白酶的攻击而水解。曲妥珠单抗的作用机制可包括：免疫诱导的生物活性(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和自然杀伤细胞活性)，诱导Her2受体内化，抑制DNA修复，破坏PI3K途径，激活p27kip1诱导的G1周期停止，刺激癌细胞凋亡和抑制受体细胞外结构域的细胞内p95结构域的激活[4,5]。其中，有关于曲妥珠单抗诱导的免疫介导的治疗性生物活性的报道。具体而言，ADCC发挥重要作用，正如在BT474异种移植小鼠模型中所显示的那样，当敲除Fc受体时，癌症生长的抑制率从96％降低到29％(NatMed,2000,6:443-6)。Kohrt等人(JClinInvest,2012.122(3):1066-75)报道称，用CD137特异性抗体刺激自然杀伤细胞增强了乳腺癌异种移植模型中曲妥珠单抗的功效。目前将曲妥珠单抗用作治疗乳腺癌的一线药物，有效治疗Her2过度表达的转移性乳腺癌，并且单药一线治疗的客观反映率为30-50％；但是在治疗Her2表达较低的转移性乳腺癌方面效果不理想，并且抗体最初在1年内有效的许多患者中已经发展出耐药性。这可能与抗原表位的遮蔽或由肿瘤细胞中某些基因表达的变化引起的受体信号传导途径的异常激活有关。另外，Her2连同该家族的其它成员(Her1、Her3和Her4)可以形成配体依赖性或配体非依赖性异源二聚体，从而激活下游途径，然后导致肿瘤细胞增殖，而曲妥珠单抗无法抑制异源二聚体形成，所以这可能是耐药性发展的原因之一。帕妥珠单抗于2012年被FDA批准在美国销售，对晚期前列腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和乳腺癌有一定治疗效果，但其治疗效果还取决于Her2表达水平。帕妥珠单抗识别Her2细胞外结构域II异源二聚化的关键位点，由此识别的表位位于II亚区中心的区段245-311，关键残基为H245、V286、S288、L295、H296和K311。其中，L295、H296是介导Her2和Her3异源二聚化的关键位点，并且L295A/H296A双重突变可完全阻断Her2/Her3的异源二聚化(Franklin,M.C.等人，InsightsintoErbBsignalingfromthestructureoftheErbB2-pertuzumabcomplex.CancerCell,2004.5(4):第317-28页)。因此，帕妥珠单抗可用于有效抑制Her2/Her3异源二聚体的形成，但对EGFR/Her2异源二聚体的形成并未显示出明显的抑制作用。目前，需要开发新的抗HER2抗体。附图说明图1显示了本专利技术的人源化双特异性抗Her2抗体的优选实施方案的结构。图2显示了制备CHO突变体CHOK1-AF的方法的流程图，其中敲除了Slc35c1基因。图3显示了通过FACS测定的CHO-K1细胞(A)和CHOK1-AF细胞(B)的岩藻糖表达水平。图4显示了MBS301的完整分子量谱。图5显示了N-糖切除修饰后MBS301的完整分子量谱。图6显示了MIL203AF、MIL204AF和MBS301的SEC-HPLC分析结果。图7显示了MIL203/204和MBS301的N-糖型的分析结果。图8显示了对SKBR-3细胞的ADCC作用。图9显示了对BT474细胞的ADCC作用。图10显示了对SW480细胞的ADCC作用。图11显示了对HCC1419的ADCC作用。图12显示了对BT474细胞的细胞直接杀伤作用。图13显示了对MDA-MB-175细胞的细胞直接杀伤作用。图14显示了对SKBR-3细胞的细胞直接杀伤作用。图15显示了对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人源化双特异性抗Her2抗体或其抗原结合片段，其包含：包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的可变区(第一VH)的第一重链，包含具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的可变区(第一VL)的第一轻链，包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的可变区(第二VH)的第二重链，和包含具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的可变区(第二VL)的第二轻链，其中所述第一VH和第一VL形成对HER2的细胞外结构域IV有特异性的第一抗原结合位点，并且所述第二VH和第二VL形成对HER2的细胞外结构域II有特异性的第二抗原结合位点。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.03.17 US 15/461,732;2016.07.22 CN 201610584241.一种人源化双特异性抗Her2抗体或其抗原结合片段，其包含：包含具有SEQIDNO:9的氨基酸序列的可变区(第一VH)的第一重链，包含具有SEQIDNO:17的氨基酸序列的可变区(第一VL)的第一轻链，包含具有SEQIDNO:10的氨基酸序列的可变区(第二VH)的第二重链，和包含具有SEQIDNO:18的氨基酸序列的可变区(第二VL)的第二轻链，其中所述第一VH和第一VL形成对HER2的细胞外结构域IV有特异性的第一抗原结合位点，并且所述第二VH和第二VL形成对HER2的细胞外结构域II有特异性的第二抗原结合位点。2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述第一重链还包含具有SEQIDNO:7的氨基酸序列的恒定区。3.根据权利要求2所述的抗体，其中所述第一重链包含SEQIDNO:22的氨基酸序列。4.根据权利要求1所述的抗体，其中所述第一轻链还包含具有SEQIDNO:19的氨基酸序列的恒定区。5.根据权利要求4所述的抗体，其中所述第一轻链包含SEQIDNO:23的氨基酸序列。6.根据权利要求1所述的抗体，其中所述第二重链还包含具有SEQIDNO:8的氨基酸序列的恒定区。7.根据权利要求6所述的抗体，其中所述第二重链包含SEQIDNO...

【专利技术属性】
技术研发人员：李锋，张伯彦，叶培，赵健，黄思佳，金春阳，
申请(专利权)人：北京天广实生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11