一种结合TROP2的抗体及靶向TROP2和CD3的双特异性抗体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及基因工程抗体技术领域，具体涉及一种结合TROP2的抗体及靶向TROP2和CD3的双特异性抗体及其制备方法与应用。本发明专利技术提供的TROP2抗体具有良好的结合TROP2的能力，亲和力高；结合TROP2和CD3的双特异性抗体同时具有优异的抗TROP2和抗CD3抗体的生物学功能，能够在肿瘤细胞和免疫效应细胞之间搭建桥梁，有效激活免疫效应细胞和导向性免疫反应，显著增强了免疫细胞杀伤肿瘤细胞的功效，同时最大程度地降低了ADCC效应，具有较高的安全性，在肿瘤的免疫治疗中具有较好的应用前景。免疫治疗中具有较好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种结合TROP2的抗体及靶向TROP2和CD3的双特异性抗体及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及基因工程抗体
，具体涉及一种结合TROP2的抗体、靶向TROP2和CD3的双特异性抗体及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]抗体药物是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的生物大分子药物，具有特异性高、性质均一、可针对特定靶点定向制备等优点。单克隆抗体在临床上主要应用于以下三个方面：肿瘤治疗、免疫性疾病治疗以及抗感染治疗。其中，肿瘤治疗是目前单克隆抗体应用最为广泛的领域，目前已经进入临床试验和上市的单克隆抗体产品中，用于肿瘤治疗的产品数量占比大概为50％。单克隆抗体治疗肿瘤是一种针对病变细胞特异靶点刺激免疫系统杀伤靶细胞的免疫疗法，为了增强抗体的效应功能，特别是提高杀伤肿瘤细胞的效果，人们尝试多种方法改造抗体分子。
[0003]获取特异性抗体的方法有多种。传统的杂交瘤技术通过免疫小鼠或大鼠，将其脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，然后进行稀释(至一个细胞每孔)培养，用酶联免疫法(ELISA)检测杂交瘤细胞上清与免疫抗原的结合，进而筛选可分泌与抗原特异性结合抗体的单克隆细胞株。这种鼠源抗体如果应用于临床药物研发，则需要通过杂合抗体技术(chimerization)、人源化技术(humanization)等基因工程手段进行去免疫原性改造。为了从起始阶段就消除未来临床必须解决的免疫原性问题，转基因鼠技术(transgenic mouse)通过替换鼠源抗体可变区为人源抗体可变区，使得获得的单克隆抗体的可变区序列主体上就是人源的，然后再进一步替换恒定区就可以获得全人源单克隆抗体。另外一个技术就是噬菌体表面呈现(phage display)技术。噬菌体表面呈现技术是在试管中构建工程抗体，一般是单链抗体或Fab形式。但是组成工程抗体的基因片段来源于人免疫细胞的基因库，所以获得的抗体是全人源的。已有多个噬菌体技术获得的抗体进入临床研究或获得批准，用于各个方面的疾病治疗。
[0004]在单克隆抗体的基础上，为了进一步提高药效和减少毒副作用，以单克隆抗体为基础的新抗体药物，包括药物偶联抗体(Antibody drug conjugate,ADC),双特异性抗体(bispecific antibody，bsAb)以及CAR
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T(chimeric antigen receptor T cells)等新型蛋白和细胞药物的发展极为迅速。其中，基于双特异性构建的细胞桥(cell
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bridging)双抗，由于具有连接免疫T细胞和癌靶细胞的能力，显著提高了杀伤活性和特异性，具有突破性的临床价值，受到了较多的关注。
[0005]双特异性抗体可通过多种途径获得，其制备方法主要有：化学偶联法、杂交
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杂交瘤法和基因工程抗体制备法。化学偶联法是将2个不同的单克隆抗体用化学偶联的方式连接在一起，制备的双特异性单克隆抗体，这是最早的双特异性单克隆抗体。杂交
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杂交瘤法是通过细胞杂交法或者三元杂交瘤的方式产生双特异性单克隆抗体，这些细胞杂交瘤或者三元杂交瘤是通过建成的杂交瘤融合，或者建立的杂交瘤和从小鼠的淋巴细胞融合而得到
的，只能用于生产鼠源的双特异性抗体，因此，其应用受到了极大的限制。而随着分子生物学技术的迅速发展，出现了基因工程人源化或全人源的双特异性抗体的多种构建模式，主要包括双特异性微抗体、双链抗体、单链双价抗体、多价双特异性抗体四类。目前，国际上已有数种基因工程双特异性抗体药物进入临床试验阶段，并显示有较好的应用前景。
[0006]滋养层细胞表面抗原2(TROP2)是由TACSTD2基因编码表达的细胞表面糖蛋白，又名肿瘤相关钙离子信号转导子2(TACSTD2)、表皮糖蛋白1(EGP
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1)、胃肠肿瘤相关抗原(GA733
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1)、表面标志物1(M1S1)，最早于人胎盘滋养层鉴定到的细胞表面糖蛋白，后来被发现高度表达于大部分人的实体肿瘤癌细胞中，且仅受限或有限地表达于正常人组织。TROP2属于GA733蛋白家族，与上皮细胞黏附分子(EpCAM，又称TROP1、TACSTD1)有较高结构序列相似性，同源性达49％。TROP2由323个氨基酸构成，其中信号肽含26个氨基酸，胞外区248个氨基酸，跨膜区23个氨基酸，胞质区26个氨基酸，其结构示意图如图1的A所示。TROP2主要通过调节钙离子信号通路、细胞周期蛋白表达及降低纤黏蛋白黏附作用促进肿瘤细胞生长、增殖和转移。TROP2也可以与Wnt信号级联中的β
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连环蛋白相互作用，因而对细胞核癌基因的转录及细胞的增殖起作用。大量临床研究和文献报道表明，TROP2在乳腺癌、胰腺癌、胆囊癌、结肠癌、胃癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、子宫癌和口腔鳞癌等上皮癌中过表达，而在成年人正常组织中很少表达或不表达；TROP2在肿瘤组织中的过表达与患者的预后不良和癌细胞的转移密切相关，同时影响患者的总生存率。因此，TROP2已成为肿瘤分子靶向治疗中引人注目的靶标。
[0007]TROP2是一种跨膜蛋白，其细胞外结构域在多种肿瘤细胞上分布广泛，因此成为了靶向治疗的天然候选。TROP2的组织表达局限性使得治疗的毒性降低，这也是靶向TROP2治疗的优势所在。以TROP2为靶点的抗体、抗体偶联物以及联合用药等多种形式的药物正处于研发中。抗TROP2抗体与其他化疗药物偶联的效用已在各种临床前研究中得到证实。用于治疗TROP2过表达的上皮恶性肿瘤的抗体偶联药物(ADC)IMMU
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132已获FDA批准上市(2020年4月)。新型抗体偶联药物Sacituzumab govitecan(IMMU
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132)是以TROP2为靶点，利用人源化抗体hRS7作为靶向载体与伊立替康活性代谢产物SN38偶联而成，可用于治疗多种上皮恶性肿瘤如乳腺癌(三阴乳腺癌)、卵巢癌、小细胞肺癌等。此外，其他人源化的抗TROP2 IgG
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SN
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38偶联物，如抗TROP2 hRS7
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CL2A
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SN
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38抗体偶联药物，已被证明在多种肿瘤细胞系(Calu
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3、Capan
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1、BxPC
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3和COLO
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205)的异种移植模型中具有显著的特异性抗癌作用。综上所述，开发一种抗TROP2的特异抗体，尤其是具备良好的TROP2抗原结合性的完全人源化抗TROP2抗体具有重要意义。
[0008]T细胞表面的CD3分子由4个亚基δ、ε、γ、ζ组成，其分子质量分别为18.9k Da，23.1kDa，20.5kDa和18.7kDa，其长度分别为171、207、182、164个氨基酸残基，其共同组成6条肽链，常与T细胞受体(T cell receptor，TCR)紧密结合形成含有8条肽链的TCR
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种TROP2抗体，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别具有SEQ ID NO.1
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3所示的氨基酸序列，或者，其分别具有以SEQ ID NO.1
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3所示的氨基酸序列为参考序列、含有如下突变中的一种或多种突变的组合的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第1位S突变为N；(2)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第4位P突变为R、K或G；(3)SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的第1位P突变为H、A；(4)SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的第2位N突变为E；所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别具有SEQ ID NO.4
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6所示的氨基酸序列，或者，其分别具有以SEQ ID NO.4
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6所示的氨基酸序列为参考序列，含有如下突变中的一种或多种突变的组合的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的第5位G突变为N或E；(2)SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的第7位S突变为R或K；(3)SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的第1位A突变为R；(4)SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的第3位S突变为G、H或R；(5)SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的第4位S突变为K。2.一种TROP2抗体，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的CDR1具有SEQ ID NO.1、7任一所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.2、8、9任一所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.3、10任一所示的氨基酸序列；轻链可变区的CDR1具有SEQ ID NO.4、11、12任一所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.5、13、14任一所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.6、15任一所示的氨基酸序列；优选地，所述重链可变区的CDR为如下任一种：(1)CDR1具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；(2)CDR1具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；(3)CDR1具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；(4)CDR1具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列；轻链可变区的CDR为如下任一种：(1)CDR1具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；(2)CDR1具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列；(3)CDR1具有SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列；(4)CDR1具有SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列；
(5)CDR1具有SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列；(6)CDR1具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列；更优选地，所述重链可变区的CDR和轻链可变区的CDR为如下任一种：(1)重链可变区的CDR1具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；轻链可变区的CDR1具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；(2)重链可变区的CDR1具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；轻链可变区的CDR1具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列；(3)重链可变区的CDR1具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；轻链可变区的CDR1具有SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列；(4)重链可变区的CDR1具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；轻链可变区的CDR1具有SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列。3.根据权利要求2所述的TROP2抗体，其特征在于，所述重链可变区具有SEQ ID NO.16、18
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20任一所示的...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁清安，白丽莉，孟庆武，李艺佳，赵立坤，李延虎，
申请(专利权)人：益科思特北京医药科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：