鉴定持留型单核细胞增生李斯特菌ST121的多重PCR检测引物、试剂盒、方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种鉴定持留型单核细胞增生李斯特菌ST121型菌株的多重PCR检测引物、试剂盒、方法及应用。本发明专利技术的多重PCR检测方法，包括检测靶标多重PCR引物设计、多重PCR体系扩增和电泳检测，若结果同时出现目标基因0609，0171、prfA条带，则证明菌株是持留型单核细胞增生李斯特菌ST121菌株，若结果出现目标基因0609，0171、prfA三条条带中的任意两条，则为其他ST型单增李斯特菌，若结果只出现prfA基因条带，则为单增李斯特菌。本发明专利技术能有效鉴定持留型单核细胞增生李斯特菌ST121菌株，具有快速、高效、灵敏度高、经济、准确和操作简单等优点，便于应用于食品、检验检疫等领域。

Detection of Listeria monocytogenes ST121 by multiplex PCR with primers, kits, methods and Applications

The invention discloses a multiplex PCR detection primer, kit, method and application for identifying Listeria monocytogenes ST121 strain of retention type. The multiplex PCR detection method includes detection target multiplex PCR primer design, multiplex PCR system amplification and electrophoresis detection. If the target genes 0609, 0171 and prfA bands appear at the same time, it proves that the strain is Listeria monocytogenes ST121 strain with retention type. If the target genes 0609, 0171 and prfA are found, any two of the three bands will be amplified for other ST types. Listeria monocytogenes were isolated if only prfA gene bands were found in Listeria monocytogenes. The invention can effectively identify Listeria monocytogenes ST121 strain, has the advantages of fast, high efficiency, high sensitivity, economy, accuracy and simple operation, and is convenient for application in the fields of food, inspection and quarantine, etc.

【技术实现步骤摘要】
鉴定持留型单核细胞增生李斯特菌ST121的多重PCR检测引物、试剂盒、方法及应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种鉴定持留型单核细胞增生李斯特菌ST121型菌株的多重PCR检测引物、试剂盒、方法及应用。
技术介绍
多重PCR是基于普通PCR于同一个反应体系中利用多对特异性引物同时扩增多段特异性检测靶标DNA的PCR技术。在多重PCR报道以来，由于其高效性、灵敏性和经济简便性，已广泛应用于核酸检测的多个领域，如转基因鉴定、病原体检测、遗传疾病诊断、单核苷酸多态性分析等；多重PCR体系，一般包括以下试剂：PCR缓冲液、Taq酶、dNTP、MgCl2、引物、模板和去离子水。单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)是一种重要的食源性致病菌，可引起严重的李斯特菌病，如脑膜炎、脑膜脑炎、流产、胸肌炎和败血症等，敏感人群主要有老人、新生儿、孕妇和免疫力低下的人群，致死率为20％-30％。近年来，我国部分城市有报道偶发李斯特菌病病例，主要人群为孕妇、新生儿等，对我国居民的身心健康造成一定的威胁。作为重要的食源性致病菌，如何鉴定和防控单增李斯特菌污染食品是降低单增李斯特菌感染的关键之一。单核细胞增生李斯特菌遗传多样性丰富，具有13种血清型，分别为1/2a，1/2b，1/2c，3a，3b，3c，4a，4b，4c，4ab，4d，4e或7型。脉冲场凝胶电泳(pulsefieldgelelectrophoresis，PFGE)是单增李斯特菌分子分型的“金标准”，但随着测序技术的发展，目前多位点序列分型(multilocussequencetyping，MLST)是单增李斯特菌遗传多样性分析的流行方法，其分辨力、稳定性均可与PFGE媲美，比血清分型具有更高的分辨力和可靠性。据法国巴斯德研究所BIGSdb-Lm数据库统计，目前单增李斯特菌已发现1459序列型(sequencetypes，STs)(截至2019年1月5日)。单增李斯特菌具有耐受低温、宽范围pH和高盐等能力，因此广泛分布于食品加工环境中。持留型菌株是指能够在同一食品生产工厂持续污染几年甚至更长时间且其遗传特征不发生改变的菌株。大量研究表明持留型菌株是单增李斯特菌在食品生产环境中持续污染终端食品的主要因素。单增李斯特菌ST121型菌株能够耐受一定剂量的消毒剂、酸碱环境和干燥等逆境环境，是长期持续性污染食品生产加工的主要元凶，对食品安全带来严重的潜在威胁。许多研究表明在鱼肉、猪肉处理车间、奶酪生产车间等食品环境中分离获得持续污染产品的单增李斯特菌分离株ST121(血清型1/2a)，表明ST121持留型菌株在不同种类食品生产环境中均长期存在，对食品生产造成了巨大的潜在微生物安全威胁。目前，采用MLST技术可以准确鉴定单增李斯特菌的ST型别，但目前DNA序列测定成本较高、耗时相对较长、且测序的准确性也直接影响MLST分型结果的准确性。随着微生物全基因组测序技术的发展，基于全基因组序列比对分析，获得ST型特异性DNA检测靶标，可以开发简单快速、廉价高效、高灵敏可靠的PCR鉴定技术。本专利技术基于全基因组比对分析技术开发的多重PCR技术可对单增李斯特菌ST121型菌株的多个特异性检测靶标同时进行检测，是直接鉴定单增李斯特菌ST121型菌株的最适宜方法之一。作为一种基于普通PCR的衍生技术，多重PCR具有以下优势：(1)高通量，在一次操作中可对多达384个样品进行鉴定；(2)高效性，同一PCR反应中可同时检测多个特异性靶标，省时省力；(3)经济性，无需进行DNA序列测定，根据靶标序列扩增DNA条带即可判断结果；(4)易于操作、耗时短，在同一PCR反应中加入多重PCR引物即可实现多个靶标的一步法同时扩增，150min内即可获得准确结果；(5)准确性，实现多个靶标的同步特异性扩增，大大降低了假阳性的可能性。随着引物对数量的增加，引物间的抑制作用降低了多重PCR的检测通量，在多重PCR技术的实际应用过程中，由于在同一反应管内添加多对引物，引物的非特异性扩增、引物间二聚体形成、PCR反应体系优化以达到每个靶标DNA序列都能有效扩增等问题限制了多重PCR技术的应用。因此，开发高通量、高灵敏度和准确可靠的单增李斯特菌ST121型菌株多重PCR鉴定技术及其相应的试剂盒，对食品生产企业检测和防控单增李斯特菌污染具有重要的价值。
技术实现思路
本专利技术通过设计ST121型菌株检测靶标-0609基因(LM6179_0609)、0171基因(LM6179_0171)和prfA基因的DNA特异性扩增引物，采用一步法进行扩增0609基因、0171基因和prfA基因这三个特异性靶标，实现对持留型单核细胞增生李斯特菌ST121型菌株的快速鉴定。通过对多重PCR检测体系的优化，开发出针对持留型单核细胞增生李斯特菌ST121型菌株鉴定的多重PCR检测试剂盒，建立了检测准确，高效的检测方法。本专利技术的第一个目的是提供一种鉴定持留型单核细胞增生李斯特菌ST121型菌株的多重PCR检测引物，所述的多重PCR检测引物如下所示：针对ST121菌株0609基因的0609-F:5'-TAGGTGACCCTGAAGCAACAACTG-3'，(其序列如SEQIDNO.1所示)；0609-R:5'-TGTGCCTCCACCGCCAGAAC-3'，(其序列如SEQIDNO.2所示)；针对ST121菌株0171基因的0171-F:5'-CAACCTACGACTACAAAGCGGGC-3'，(其序列如SEQIDNO.3所示)；0171-R:5'-TCTTGGTATTCCAGCTTGCGTTAG-3'，(其序列如SEQIDNO.4所示)；针对单核细胞增生李斯特菌菌株prfA基因的prfA-F:5'-ATGAACGCTCAAGCAGAAGAAT-3'，(其序列如SEQIDNO.5所示)；prfA-R:5'-ATAATAGCCAACCGATGTTTCTG-3'，(其序列如SEQIDNO.6所示)；。本专利技术的第二个目的是提供一种鉴定持留型单核细胞增生李斯特菌ST121型菌株的多重PCR检测试剂盒，所述的多重PCR检测试剂盒包含上述的多重PCR检测引物0609-F、0609-R、0171-F、0171-R、prfA-F和prfA-R。所述的多重PCR检测试剂盒还包括TaqDNA聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR缓冲液和无菌去离子水。本专利技术的第三个目的是提供一种鉴定持留型单核细胞增生李斯特菌ST121型菌株的多重PCR检测方法，该方法包括以下步骤：以待测菌株的基因组DNA(如待测单核细胞增生李斯特菌菌株的基因组DNA)作为模板，利用上述的多重PCR检测引物0609-F、0609-R、0171-F、0171-R、prfA-F和prfA-R对ST121型菌株的特异性检测靶标0609基因(700bp)、0171基因(511bp)和prfA基因(225bp)进行多重PCR扩增，若同时扩增出目标基因0609(700bp)、0171(511bp)、prfA(225bp)条带，则证明菌株是持留型单核细胞增生李斯特菌ST121菌株，若扩增出目标基因0609(700bp)、0171(511bp)、prfA(225bp)三条条带中的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定持留型单核细胞增生李斯特菌ST121型菌株的多重PCR检测引物，其特征在于，所述的多重PCR检测引物如下所示：针对ST121菌株0609基因的0609‑F:5'‑TAGGTGACCCTGAAGCAACAACTG‑3'，0609‑R:5'‑TGTGCCTCCACCGCCAGAAC‑3'；针对ST121菌株0171基因的0171‑F:5'‑CAACCTACGACTACAAAGCGGGC‑3'，0171‑R:5'‑TCTTGGTATTCCAGCTTGCGTTAG‑3'；针对单核细胞增生李斯特菌菌株prfA基因的prfA‑F:5'‑ATGAACGCTCAAGCAGAAGAAT‑3'，prfA‑R:5'‑ATAATAGCCAACCGATGTTTCTG‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种鉴定持留型单核细胞增生李斯特菌ST121型菌株的多重PCR检测引物，其特征在于，所述的多重PCR检测引物如下所示：针对ST121菌株0609基因的0609-F:5'-TAGGTGACCCTGAAGCAACAACTG-3'，0609-R:5'-TGTGCCTCCACCGCCAGAAC-3'；针对ST121菌株0171基因的0171-F:5'-CAACCTACGACTACAAAGCGGGC-3'，0171-R:5'-TCTTGGTATTCCAGCTTGCGTTAG-3'；针对单核细胞增生李斯特菌菌株prfA基因的prfA-F:5'-ATGAACGCTCAAGCAGAAGAAT-3'，prfA-R:5'-ATAATAGCCAACCGATGTTTCTG-3'。2.一种鉴定持留型单核细胞增生李斯特菌ST121型菌株的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的多重PCR检测试剂盒包含权利要求1所述的多重PCR检测引物。3.根据权利要求2所述的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的多重PCR检测试剂盒还包括TaqDNA聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR缓冲液和无菌去离子水。4.一种鉴定持留型单核细胞增生李斯特菌ST121型菌株的多重PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：以待测菌株样本的基因组DNA作为模板，利用权利要求1所述的多重PCR检测引物进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈谋通，吴清平，张菊梅，程健恒，庞锐，陈月桃，曾海燕，王涓，丁郁，吴诗，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所广东省微生物分析检测中心，
类型：发明
国别省市：广东,44