利用来自细菌基因组和质粒的全部基因信息集用于改善的基因抗性测试制造技术

本发明专利技术涉及确定微生物的抗微生物药物抗性谱的方法，其中分析所述微生物的核酸序列中的至少两个核酸序列的基因变异，所述至少两个核酸序列的基因变异包含染色体中的至少一个基因变异和至少一个质粒中的至少一个基因变异；以及确定患者感染了对抗微生物药物治疗可能具有抗性的微生物的(例如诊断)方法和选择对患有可能具有抗性的微生物感染的患者的治疗的方法，其中应用所述抗微生物药物抗性谱的数据。

Improvement of gene resistance testing using a complete set of genetic information from bacterial genomes and plasmids

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】利用来自细菌基因组和质粒的全部基因信息集用于改善的基因抗性测试本专利技术涉及确定微生物的抗微生物药物抗性谱的方法，其中分析所述微生物的核酸序列中的至少两个所述核酸序列的基因变异，所述基因变异包含染色体中的至少一个基因变异和至少一个质粒中的至少一个基因变异；以及确定患者感染了对抗微生物药物治疗可能具有抗性的微生物的(例如诊断)方法以及选择对患有可能具有抗性的微生物感染的患者的治疗的方法，其中应用所述抗微生物药物抗性谱的数据。抗生素抗性是药物抗性的一种形式，借此微生物亚群如细菌物种的菌株，尽管暴露于抗生素类药物，但也可存活并增殖。这是重要的公共健康问题，也是对于个体患者而言的严重的健康问题。细菌感染的及时治疗需要分析获自患者的临床分离物的抗生素抗性，以选择有效的疗法。通常，出于此目的，将鉴定的抗性与某一微生物(即ID)关联是必要的。抗菌药物抗性(ADR)代表了主要的健康负担。如同所假设的，针对活性剂的细菌抗性的存在和发生正在更加快速地获得重视。增加使用可用药物产生了多抗性细菌，这进而需要甚至更困难的医疗处理。根据世界卫生组织关于监督的抗微生物抗性全球报告，ADR在欧洲每年导致25,000例死亡，在美国每年导致23,000例死亡。在欧洲，额外的250万住院日导致15亿欧元的社会成本。在美国，2百万病例的直接费用导致200亿美元的直接费用。总费用估计高得多，使国内生产总值(GDP)降低高达1.6％。一般而言，细菌针对抗微生物治疗的抗性机制很大一部分依赖于生物体的遗传。相应的基因或分子机制在细菌基因组中编码或者在可在不同细菌之间互换的质粒上编码。最常见的抗性机制包括：1)外排泵是位于膜内的高亲和力反向运输系统，其将抗生素运输至细胞外，例如针对四环素的抗性。2)特定的酶以使抗生素丧失其活性的方式对抗生素进行修饰。在链霉素的情况下，抗生素被化学修饰，以使其不再结合核糖体阻止蛋白合成。3)产生降解抗生素的酶，从而使其失活。例如，青霉素酶是一组剪切青霉素分子的β内酰胺环的β-内酰胺酶。此外，一些病原体显示出针对药物的天然抗性。例如，生物体可以缺乏针对抗生素的运输系统，或者生物体中不存在抗生素分子的靶标。原则上对药物敏感的病原体可以通过既有遗传物质的修饰(例如，抗生素抗性的自发突变，其在感染中以约1/1亿个细菌的频率发生)或者从其它来源获得新的遗传物质而变得具有抗性。一个实例是水平基因转移，其是这样的过程：DNA小包中包含的遗传物质可在同一物种的个体细菌之间，甚至在不同物种之间转移。水平基因转移可以通过转导、转化或接合发生。通常，赋予抗性的标志物的表达仅由药物的存在诱导。通常，通过在不同浓度的这些试剂中培养微生物来进行针对抗微生物剂的敏感性/抗性的测试。简言之，将琼脂平板接种患者样品(例如，尿液、痰、血液、粪便)过夜。在第二天，通过培养或者利用质谱法，各个集落被用于鉴定生物体。基于生物体的身份，接种含有增加浓度的用于处理这些生物体的药物的新平板，并另外生长12-24小时。使用抑制生长的最低药物浓度(最小抑菌浓度-MIC)以确定对所测试的药物的敏感性/抗性。该过程耗费至少2至3个工作日，在这过程中凭经验对患者进行治疗。自动化系统来自几个公司，例如Biomeriux(Vitek)、BeckmanCoulter(Microscan)。尤其是在患有危及生命的疾病的患者中为了克服抗生素的广泛滥用，需要显著降低的结果效率(time-to-result)。较新的方法专注于病原体的基因组成，并且跨越来自对单抗性标志物在小型专用板的低重测试的整个谱和将富集的测序靶向至细菌的整个基因组测序。这些方法已经证实了使对患有传染性疾病的患者的护理发生变革的显著可能性。近期的发展包括用于快速细菌鉴定的基于PCR的测试试剂盒(例如，BiomerieuxBiofireTests，CuretisUnyveroTests)。利用这些测试，对于非常有限数目的药物而言，检测所选择的抗性基因座是可能的，但是不能给出与基于培养的AST的关联。质谱法越来越多地用于鉴定临床样品中的病原体(例如，BrukerBiotyper)，并且正在进行研究以建立检测针对抗生素的敏感性/抗性的方法。使用用于直接检测MRSA的分子技术已经变得越来越普通，尤其对于筛选目的而言。对甲氧西林的抗性由mec操纵子介导，该操纵子为葡萄球菌的盒染色体mec(SCCmec)的一部分。最近引入的PCR测试基于检测SCCmec的右末端序列，并结合金黄色葡萄球(S.aureus)特异性标志物。存在描述基于培养物的敏感性报道的初始报道，尽管检测到赋予抗性的基因的存在。已知药物抗性可与基因修饰如多态性或基因重复/缺失相关。这适用于病毒，其中在临床实践中建立了抗性测试(例如，HIV基因型分型)。最近，已显示，抗性在细菌甚至更高级生物体(如人类)中也具有遗传原因，其中肿瘤对某些细胞抑制剂的抗性可与基因组突变相关。Wozniak等人(BMCGenomics2012，13(增刊7)：S23)公开了基于基因型和表型数据，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)中药物抗性的基因决定因子。Stoesser等人公开了利用全基因组序列数据，对大肠杆菌(Escherichiacoli)和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumonia)分离株的抗微生物敏感性的预测(JAntimicrobChemother2013；68：2234-2244)。Chewapreecha等人(Chewapreecha等人(2014)ComprehensiveIdentificationofsinglenucleotidpolymorphismsassociatedwithbeta-lactamresistancewithinpneumococcalmosaicgenes.PLoSGenet10(8)：e1004547)利用可比较的方法鉴定出革兰氏阳性肺炎链球菌(StreptococcusPneumonia)中的突变。然而，对具有抗微生物药物抗性的微生物，特别是细菌种类的感染存在改善的检测需求，并且改善的对抗细菌疗法的应答的预测仍代表高度未满足的临床需求。专利技术概述尽管现有技术的其他方法通常聚焦于点突变，但较早的发现表明可以以两种方式获得对抗性的改善的预测性能：a)机器学习方法可以用于组合单点突变的预测能力。这些弱的学习者位于细菌染色体上。b)对于一些药物，点突变不产生高的预测能力。因此，我们增加了较大的结构变体诸如存在或不存在的基因以提高分类精度。除了染色体之外，基因抗性信息还可以编码在细菌质粒上。这些例如利用水平的基因转移在不同的菌株之间交换。本申请的专利技术人因此扩展了先前集中在染色体基因的分析，并首次限定了泛基因组。这些含有来自染色体和质粒的全部基因集合。在第一方面，上文描述的a)点得到加强。通过使用更多的基因变体，通常会获得更好的性能。作为分析的结果，本申请的专利技术人发现，核酸序列的至少两个基因变异的组合检测能够提高针对抗微生物药物(例如抗生素药物)的抗性/敏感性微生物，尤其是细菌微生物的诊断，所述基因变异包含染色体中的至少一个基因变异和至少一个质粒中的至少一个基因变异。根据第一方面，本专利技术涉及确定微生物的抗微生物药本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.确定微生物的抗微生物药物抗性谱的方法，其包括：‑获得或者提供所述微生物的多个临床分离物的核酸序列的第一数据集，其中将所述第一数据集的核酸序列的至少一部分组装；和/或获得或者提供所述微生物的多个临床分离物的核酸序列的第一数据集并将所述第一数据集的核酸序列与至少一个参照序列进行比对；‑分析所述第一数据集的核酸序列中所述核酸序列的至少两个基因变异以获得结构变体的第三数据集，所述至少两个基因变异包含染色体中的至少一个基因变异和至少一个质粒中的至少一个基因变异；‑提供所述微生物的多个临床分离物的抗微生物药物抗性和/或敏感性的第二数据集；‑将所述第三数据集与所述第二数据集关联，并对所述关联进行统计学分析；以及‑确定所述微生物的核酸序列中与抗微生物药物抗性相关的基因变异。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.04.14 EP 16165319.11.确定微生物的抗微生物药物抗性谱的方法，其包括：-获得或者提供所述微生物的多个临床分离物的核酸序列的第一数据集，其中将所述第一数据集的核酸序列的至少一部分组装；和/或获得或者提供所述微生物的多个临床分离物的核酸序列的第一数据集并将所述第一数据集的核酸序列与至少一个参照序列进行比对；-分析所述第一数据集的核酸序列中所述核酸序列的至少两个基因变异以获得结构变体的第三数据集，所述至少两个基因变异包含染色体中的至少一个基因变异和至少一个质粒中的至少一个基因变异；-提供所述微生物的多个临床分离物的抗微生物药物抗性和/或敏感性的第二数据集；-将所述第三数据集与所述第二数据集关联，并对所述关联进行统计学分析；以及-确定所述微生物的核酸序列中与抗微生物药物抗性相关的基因变异。2.如权利要求1所述的方法，其中所述基因变异针对所述微生物的泛基因组来注释和/或针对一个或多个参照基因组来注释。3.如前述权利要求中的一项或多项所述的方法，其中所述方法包括确定所述微生物对一种或多种抗微生物药物的抗性。4.如前述权利要求中的一项或多项所述的方法，其中所述抗微生物药物选自阿莫西林/克拉维酸钾(AUG)、氨苄西林(AM)、氨曲南(AZT)、头孢唑林(CFZ)、头孢吡肟(CPE)、头孢噻肟(CFT)、头孢他啶(CAZ)、头孢曲松(CAX)、头孢呋辛(CRM)、头孢噻吩(CF)、环丙沙星(CP)、厄他培南(ETP)、庆大霉素(GM)、亚胺培南(IMP)、左氧氟沙星(LVX)、美罗培南(MER)、哌拉西林/他唑巴坦(P/T)、氨苄西林/舒巴坦(A/S)、四环素(TE)、妥布霉素(TO)、以及甲氧苄啶/磺胺甲恶唑(T/S)。5.如前述权利要求中的一项或多项所述的方法，其中确定...

【专利技术属性】
技术研发人员：瓦伦蒂娜·加拉塔，安德烈亚斯·凯勒，霍尔格·奎斯特，苏珊娜·施默尔克，
申请(专利权)人：阿瑞斯遗传股份有限公司，
类型：发明
国别省市：奥地利,AT