一种柑橘黄龙病菌荧光定量分析的内参基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种柑橘黄龙病菌荧光定量分析的内参基因及其应用，内参基因为gyrA和ftsZ，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。本发明专利技术首次筛选出适用于柑橘黄龙病菌感染不同寄主、感染寄主后不同时期时基因表达分析的内参基因组合gyrA和ftsZ，进一步提供了其特异性引物，为柑橘黄龙病菌基因的准确定量检测提供可靠保证，同时可以以此来检测样本是否感染柑橘黄龙病菌。本发明专利技术筛选出的内参基因组合gyrA和ftsZ具有可靠性高、稳定性好和适用性广的优势。利用此内参基因组合构建的对柑橘黄龙病菌的检测方法及检测试剂盒相比单个或传统的内参基因具有巨大的优势，值得大面积推广和应用。

Internal Reference Gene for Quantitative Fluorescence Analysis of Citrus Yellow Dragon Disease and Its Application

The invention discloses an internal reference gene for quantitative fluorescence analysis of Citrus Yellow Dragon fungus and its application. The internal reference genes are gyrA and ftsZ, and their nucleotide sequences are shown as SEQ ID NO.9 and SEQ ID NO.10, respectively. For the first time, gyrA and ftsZ, which are suitable for gene expression analysis of Citrus Yellow Dragon fungus in different host and different period after infection, are screened, and their specific primers are further provided, which can provide reliable guarantee for accurate quantitative detection of Citrus Yellow Dragon fungus genes, and can be used to detect whether samples are infected with Citrus yellow Dragon fungus. The internal reference genome combination gyrA and ftsZ selected by the invention has the advantages of high reliability, good stability and wide applicability. Compared with single or traditional reference genes, the detection kit of Citrus Yellow Dragon pathogen based on the combination of internal reference genes has great advantages, and it is worth popularizing and applying in a large area.

【技术实现步骤摘要】
一种柑橘黄龙病菌荧光定量分析的内参基因及其应用
本专利技术属于分子植物病理学
更具体地，涉及一种柑橘黄龙病菌荧光定量分析的内参基因及其应用。
技术介绍
柑橘黄龙病(CitrusHuanglongbing，HLB)是柑橘生产上最具毁灭性的病害之一，严重制约了我国柑橘产业的发展。目前普遍认为柑橘黄龙病由一种限于韧皮部筛管细胞的革兰氏阴性细菌引起。该细菌属于α-变形菌纲(Proteobacteriacea)的候选韧皮部杆菌属(CandidatusLiberibacterspp.)；根据热敏性和地区可分为耐热型亚洲种(CandidatusLiberibacterasiaticus，CLas)、在巴西发生的美洲种(CandidatusLiberibacteramericanus，CLam)和在南非发生的非洲种(CandidatusLiberibacterafricanus，CLaf)，可感染几乎所有柑橘属植物，且表现出不同的症状。研究表明，黄龙病菌体内与转录调节、运输系统、代谢途径、分泌系统和抗逆性相关的基因在昆虫寄主与植物寄主中的表达存在差异。黄龙病菌基因在不同植物寄主上的表达存在差异，故不同寄主植物感染黄龙病后的发病进程和病害症状也存在差异。通过实时荧光定量PCR(Real-timequantitativePCR，RT-qPCR)方法对mRNA表达量进行相对定量是基因表达研究的常用方法，该方法通过荧光强度的积累实时反应PCR进程，对起始模板进行定量分析。由于用于RNA提取的细胞起始数不同、样品间RNA提取效率不同、目的基因扩增效率不同等因素，选择合适的内参基因进行相对定量分析十分重要。早期研究选择的内参基因多为管家基因，并人为假设管家基因在每个样品中表达量相同。然而，由于受内外环境的影响，在细胞中真正恒定表达的基因并不存在，所以需要根据试验对象和试验条件筛选内参基因。一些传统的内参基因如18SrRNA、β-Actin、GAPDH常被用于数据标准化，目前已有报导，利用16SrRNA作为参照基因分析柑橘黄龙病菌在甜橙(Citrussinensis)与柑橘木虱(Diaphorinacitri)寄主上的基因表达差异。研究表明，不同宿主环境对植物病原菌的基因调控有显著影响，不同植物寄主中柑橘黄龙病菌存在不同的基因调控行为。同时RT-qPCR最低标准(minimuminformationforpublicationofquantitativereal-timePCRexperiments，MIQE)表明没有适用于所有实验条件的内参基因。因此，目前需找到一种更可靠、适应性更广、表达稳定的内参基因，并以此提出更准确的检测方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术缺少一种合适的柑橘黄龙病RT-qPCR检测用内参基因的缺陷和不足，提供一种柑橘黄龙病菌荧光定量内参基因的引物及其应用。本专利技术的第一个目的是提供一个柑橘黄龙病菌RT-qPCR分析的内参基因组合。本专利技术的第二个目的是提供所述内参基因组合在柑橘黄龙病菌RT-qPCR分析，或制备柑橘黄龙病菌RT-qPCR分析试剂盒中的应用。本专利技术的第三个目的是提供基因gyrA的扩增引物。本专利技术的第四个目的是提供基因ftsZ的扩增引物。本专利技术的第五个目的是提供基因gyrA的扩增引物和/或基因ftsZ的扩增引物在柑橘黄龙病菌RT-qPCR分析，或制备柑橘黄龙病菌RT-qPCR分析试剂盒中的应用。本专利技术的第六个目的是提供一种柑橘黄龙病菌的RT-qPCR分析方法。本专利技术的第七个目的是提供一个柑橘黄龙病菌RT-qPCR分析的试剂盒。本专利技术的第八个目的是提供任一所述试剂盒在检测寄主体内柑橘黄龙病菌的应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：本专利技术同时考虑到了柑橘黄龙病菌感染不同寄主和感染寄主后不同时期这两个因素对基因表达的影响，选择柑橘黄龙病菌侵染不同植物寄主以及侵染后不同时期的植株叶片作为试验材料，通过SPSS、geNorm、NormFinder及RefFinder软件对14个候选内参基因的表达水平Ct值进行稳定性评价，筛选该试验条件下合适的内参基因。目前常用的稳定性评价软件包括geNorm、NormFinder及BestKeeper。其中BestKeeper实质为比较标准差，且一次性最多评价10个基因，因而本试验采用SPSS软件标准差比较方法代替。本研究中，以上3种软件的分析结果存在一定差异，因此基于RefFinder综合排序结果进行内参基因选择，避免单个软件分析的片面性。同时排除geNorm软件大于M值的基因以及NormFinder和标准差排序相差过大的基因，使得筛选结果更可靠。进一步验证表明，gyrA和ftsZ内参基因组合应用于目标基因标准化具有可靠性。一个柑橘黄龙病菌RT-qPCR分析的内参基因组合，包括基因gyrA和ftsZ，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示。优选地，所述内参基因组合检测的对象包括十月橘、柚、年橘和柠檬。优选地，所述内参基因组合检测对象为感染柑橘黄龙病菌后3～18个月。所述内参基因组合在柑橘黄龙病菌RT-qPCR分析，或制备柑橘黄龙病菌RT-qPCR分析试剂盒中的应用，也在本专利技术保护范围之内。基因gyrA的扩增引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.2～3所示。SEQIDNO.2：5’-CACGAAAAGCAACAAAAGCC-3’；SEQIDNO.3：5’-AGCGTCAATATGGTTGCTTTGA-3’。其扩增产物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，5’-CACGAAAAGCAACAAAAGCCTTGAGTATTCCTATGAGGGTAAAACGCTCAGGTTTATATCCATTCAAAGCAACCATATTGACGCT-3’；基因ftsZ的扩增引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.5～6所示。SEQIDNO.5：5’-CTTCCACCGGTAATTTTGGGG-3’；SEQIDNO.6：5’-AGATAGCTCTCTGACAACGCA-3’。其扩增产物核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，5’-CTTCCACCGGTAATTTTGGGGAAGAAAGATTCAAAAATTTTGCGTTTTTTAAAGATTCATGCGTTGTCAGAGAGCTATCT-3’。基因gyrA的扩增引物和/或基因ftsZ的扩增引物在柑橘黄龙病菌RT-qPCR分析，或制备柑橘黄龙病菌RT-qPCR分析试剂盒中的应用，也在本专利技术保护范围之内。优选地，所述基因gyrA的扩增引物核苷酸序列如SEQIDNO.2～3所示。优选地，所述基因ftsZ的扩增引物核苷酸序列如SEQIDNO.5～6所示。一种柑橘黄龙病菌的RT-qPCR分析方法，所述内参基因组合作为内参基因设计引物进行检测。优选地，所述基因gyrA的扩增引物核苷酸序列如SEQIDNO.2～3所示。优选地，所述基因ftsZ的扩增引物核苷酸序列如SEQIDNO.5～6所示。一个柑橘黄龙病菌RT-qPCR分析的试剂盒，含有所述内参基因组合的扩增引物。优选地，含有核苷酸序列如SEQIDNO.2～3所示和/或核苷酸序列如SEQIDNO.5～6所示扩增引物。优选地，含有核苷酸序列如SEQIDNO.2～本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一个柑橘黄龙病菌RT‑qPCR分析的内参基因组合，其特征在于，包括基因

【技术特征摘要】
1.一个柑橘黄龙病菌RT-qPCR分析的内参基因组合，其特征在于，包括基因gyrA和ftsZ，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示。2.权利要求1所述内参基因组合在柑橘黄龙病菌RT-qPCR分析，或制备柑橘黄龙病菌RT-qPCR分析试剂盒中的应用。3.基因gyrA的扩增引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.2～3所示。4.基因ftsZ的扩增引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.5～6所示。5.基因gyrA的扩增引物和/或基因ftsZ的扩增引物在柑橘黄龙病菌RT-qPCR分析，或制备柑橘黄龙病菌RT-qPCR分析试剂盒中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：许美容，郑永钦，郑正，邓晓玲，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44