一种快速检测粪便具核梭杆菌的引物组、方法及其应用技术

本发明专利技术公开了具核梭杆菌的引物组信息、定量PCR检测方法及其应用。根据NCBI数据库中细菌的16S rRNA核酸序列和BLAST功能，利用引物设计软件Primer Primer 5进行设计具核梭杆菌相关引物及V3‑V4引物，并对引物进行鉴定。从粪便样本中提取总菌的基因组信息，利用引物进行qPCR，计算获得具核梭杆菌的相对含量。以上述检测方法为原理，利用具核梭杆菌引物研制肠道微生态检测试剂盒。利用试剂盒进行实际检测，结果显示肠道微生态患者和肠癌患者粪便样本中具核梭杆菌含量显著异于正常人。本发明专利技术中具核梭杆菌的特异性引物、快速准确的检测方法和肠道微生态试剂盒的研发，为了解肠道微生态的分布，以及疾病的预测和初步筛选提供方法。

A Rapid Method for Detecting Clostridium Nucleosum in Feces and Its Application

\u672c\u53d1\u660e\u516c\u5f00\u4e86\u5177\u6838\u68ad\u6746\u83cc\u7684\u5f15\u7269\u7ec4\u4fe1\u606f\u3001\u5b9a\u91cfPCR\u68c0\u6d4b\u65b9\u6cd5\u53ca\u5176\u5e94\u7528\u3002 According to the 16S rRNA nucleic acid sequence and BLAST function of bacteria in NCBI database, primer design software Primer 5 was used to design primers related to Clostridium nucleus and V3_V4 primers, and the primers were identified. Genome information of total bacteria was extracted from fecal samples, and the relative content of Clostridium nucleatum was calculated by qPCR with primers. Based on the above detection methods, a kit for intestinal microecology detection was developed with Clostridium nucleatum primers. The results showed that the content of Clostridium nucleatum in stool samples of intestinal microecology patients and intestinal cancer patients was significantly different from that of normal people. The invention has specific primers of Clostridium nucleus, rapid and accurate detection method and intestinal microecology kit development, in order to understand the distribution of intestinal microecology, and provide a method for disease prediction and preliminary screening.

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测粪便具核梭杆菌的引物组、方法及其应用
本专利技术属于生物医学检测
，致力于专利技术一种快速鉴定粪便中具核梭杆菌的方法，涉及肠道具核梭杆菌引物组、分子检测方法及其应用。
技术介绍
具核梭杆菌（Fusobacteriumnucleatum）属于革兰氏阴性专性厌氧菌，不仅与口腔疾病有关，还参与了败血症，盆腔炎，脑、肝、肺、脾等脏器部位的脓肿和结直肠癌的生物学过程。具核梭杆菌拥有多种凝集蛋白，可凝集红细胞，黏附于上皮细胞和羟磷灰石表面。既可以与早期定植菌如放线菌共聚，又可与晚期定植菌如牙龈卟啉单胞菌属、血链球菌、幽门螺杆菌和放线菌共聚。随着生活水平的提高，人们饮食结构的改变，大肠癌的发病率和病死率逐年上升。近年来，具核梭杆菌与结直肠癌的研究越来越多。研究显示，人类大肠癌细胞表面有糖Gal-GalNA的富集，该糖能够与具核梭杆菌表面Fap2蛋白结合，使具核梭杆菌定植在原位结肠肿瘤部位，并在此增殖，此外，T细胞介导的适应性免疫反应在抑制肿瘤发展中具有重要作用，而具核梭杆菌可通过抑制T细胞增殖，导致肠癌中T细胞死亡，加速大肠癌的发展。具核梭杆菌还可以通过诱导癌细胞的自噬，导致化疗耐药，增加术后复发，降低患者生存率。因此具核梭杆菌的快速鉴定和检测，对于肠癌患者的早期发现，合理治疗提供新的途径。目前对具核梭杆菌的检测有多种方法。由于具核梭杆菌为专性厌氧菌，分离培养条件要求高，耗时较长，不利于快速检测，并且临床标本量少，菌种较多，分离培养技术在临床应用中常受到限制。免疫检测和酶联免疫吸附法虽然具有较好的稳定性，但是研究过程中涉及抗体的制备，耗时较长，且特异性较差。DNA探针检测具有更高的检测效率，省时省力，还可以排除厌氧菌不易存活的假阴性结果。然而全基因探针在检测具核梭杆菌中易于其他同源细菌（如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌等）产生交叉反应，在以往的应用中容易产生假阴性或假阳性的结果。因此在具核梭杆菌的鉴定方面我们需要更快速，特异性更高的检测方法。基于DNA分析的定量PCR（qPCR）技术，因其污染少、灵敏度高、特异性高，且操作简便快速等特点，已成为当前分子微生物学及微生物生态学中的关键技术，被广泛用于微生物群落的快速定量检测。本研究采集受试者的粪便标本，利用具核梭杆菌的特异性引物，致力于研究出一种对粪便中具核梭杆菌的快速鉴定和相对定量检测方法，该方法可用于肠道微生态检测试剂盒的研发，用于对人体疾病的预测。
技术实现思路
本专利技术的目的主要在于为粪便中具核梭杆菌的鉴定和相对含量检测设计特异性引物，以及快速准确的鉴定方法，并研发相关微生态检测试剂盒。研究所需菌株均来源于受试者的粪便样本，利用常安易TM粪便采集盒采集受试者的粪便样本，于本实验室2-8℃保存。根据NCBI数据库中细菌的16SrRNA核酸序列，并利用引物设计软件PrimerPrimer5设计具核梭杆菌和总菌V3-V4引物。所述引物长度18-25bp左右，例如可以是18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp或25bp，优选为20bp。避免产生二级结构。所述引物组合物的GC含量为50-60%，例如可以是50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%或60%。所述引物Tm值58-63℃，例如可以是58℃、59℃、60℃、61℃、62℃或63℃，优选为60℃。共获得6对具核梭杆菌引物，分别为：F-P1F:TCAGTGTCTTCGGGGAAACC，F-P1R:CCCCACCTTCCTCCTACTCA；F-P2F:CAGTGTCTTCGGGGAAACCT，F-P2R:ACCCATTGTAGCACGTGTGT；F-P3F:TCCACGCCGTAAACGATGAT，F-P3R:GGTTTCCCCGAAGACACTGA；F-P4F:CTGGGGAGTACGTACGCAAG，F-P4R:AGGTTTCCCCGAAGACACTG；F-P5F:TCGGGGAAACCTAAAGACAGG，F-P5R:TCCACTTCACAGCTTTGCGA；F-P6F:CAACCATTACTTTAACTCTACCATGTTCA，F-P6R:GTTGACTTTACAGAAGGAGATTATGTAAAAATC。总菌引物如下：T-P1F：TCCGTGSTGCAYGGYTGTCGTCAG，T-P1R：AGGTACGTCRTCCMCACCTTCCTC；T-P2F：CCTTGTGSTGCAYGGYTGTCGTCA，T-P2R：ATCCACGTCRTCCMCACCTTCCTC。通过NCBI网站上的BLAST功能对引物进行鉴定。最终确定具核梭杆菌引物序列为P6Forward：5’-CAACCATTACTTTAACTCTACCATGTTC-3’和Reverse：5’-GTTGACTTTACAGAAGGAGATTATGTAAAAATC-3’；总菌引物为对PCR反应体系及条件的优化。通过Qubit测定样本DNA浓度，设置DNA起始量梯度进行实验，Ct值≤35对应的DNA起始量为可接受范围。通过标准曲线测试反应性能，若标准曲线的扩增效率达到90-105%，线性相关系数R2>0.98，且每个梯度重复样本之间Ct值接近，则说明反应体系性能良好。通过梯度qPCR实验，根据溶解曲线以及电泳图确定最适退火温度为60℃。利用粪便基因组DNA提取试剂盒提取待测粪便样本中基因组。以粪便菌群基因组DNA为模板，利用引物，进行qPCR。PCR实验条件：95℃预变性3min；95℃变性15S，最适退火温度退火1min，共45个循环。60℃进行荧光采集。获得具核梭杆菌的Ct值和总菌Ct值，计算样本中具核梭杆菌的相对含量。以上述方法为原理，利用具核梭杆菌特异性引物，研制肠道微生态检测试剂盒，试剂盒中配备了总菌16SrRNA为内参，设置无菌水作为阳性对照，具核梭杆菌上下游引物0.5ul作为阴性对照。预混液包括PCR反应液和对应的引物，引物终浓度为0.25-1.25ng/μL，每个孔中反应液浓度如下：具核梭杆菌PCR反应液：Tris-HCl：60mmol/L，pH8.5；硫酸铵：40mmol/L；MgCl2：5.5mmol/L；dNTPs：400μmol/L；总菌PCR反应液：Tris-HCl：40mmol/L，pH8.5；硫酸铵：30mmol/L；MgCl2：3mmol/L；dNTPs：300μmol/L；阴性对照PCR反应液：Tris-HCl：40mmol/L，pH8.5；硫酸铵：30mmol/L；MgCl2：3mmol/L；dNTPs：300μmol/L；阳性对照PCR反应液：Tris-HCl：40mmol/L，pH8.5；硫酸铵：30mmol/L；MgCl2：3mmol/L；dNTPs：300μmol/L；试剂盒检测结果有效性判定如下：（1）阴性对照：无典型S型扩增曲线。（2）阳性对照：呈典型S型扩增曲线且Ct值≤30。（3）检测样本的Ct值应＜40。（4）在同时满足1、2、3的条件下，实验有效，否则无效。本专利技术中，同时满足（1）-（3）的条件下证明实验有效，若阴性对照出现典型S性扩增曲线表明实验环境污染或操作不当；若所有孔均无典型S型扩增曲线表明试剂可能失效或仪器问题或操本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.肠道细菌具核梭杆菌实时荧光定量PCR引物的设计方法，其特征在于：优选地，所述引物组合物的引物长度为18‑25bp，优选为20bp；优选地，所述引物组合物的GC含量为50‑60%；优选地，所述引物组合物的Tm值为58‑63℃，优选为60℃。

【技术特征摘要】
1.肠道细菌具核梭杆菌实时荧光定量PCR引物的设计方法，其特征在于：优选地，所述引物组合物的引物长度为18-25bp，优选为20bp；优选地，所述引物组合物的GC含量为50-60%；优选地，所述引物组合物的Tm值为58-63℃，优选为60℃。2.按照权利要求1所述的方法设计具核梭杆菌和总菌的引物，其特征在于具核梭杆菌引物序列为：SEQIDNO.1-12，总菌引物为：SEQIDNO.13-16。3.如权利要求2所述设计的引物序列，在NCBI网站上NucleotideBLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）功能进行序列比对，其特征在于最终确定具核梭杆菌引物对为P-P6F：5’-CAACCATTACTTTAACTCTACCATGTTCA-3’，P-P6R：5’-GTTGACTTTACAGAAGGAGATTATGTAAAAATC-3’；总菌引物为T-P1F:5’-TCCGTGSTGCAYGGYTGTCGTCAG-3’，T-P1R：5’-AGGTACGTCRTCCMCACCT...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱永亮，穆延召，杨敏，靖星宇，吴楠，王一伟，
申请(专利权)人：江西普瑞森基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江西,36