一种ZnT8重组蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种ZnT8重组蛋白及其制备方法和应用，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，本发明专利技术通过分析筛选目的片段、优化编码序列和载体，转染Expi 293真核细胞，稳定表达具有抗原活性的蛋白，提供了一种既能保留天然蛋白的生物活性又能降低生产成本的制备方法，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

A ZnT8 Recombinant Protein and Its Preparation and Application

The present invention provides a zinc T8 recombinant protein and its preparation method and application. The amino acid sequence of the protein is shown in SEQ ID NO.1 and the nucleotide sequence of the protein is shown in SEQ ID NO.2. The present invention provides an antigen-active protein stable expression by analyzing and screening target fragments, optimizing coding sequences and vectors, transfecting Expi 293 eukaryotic cells, and providing a guarantee. The bioactivity of natural proteins can also reduce the production cost. It has broad application prospects and great market value.

【技术实现步骤摘要】
一种ZnT8重组蛋白及其制备方法和应用
本专利技术属于生物
，涉及一种ZnT8重组蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
锌转运蛋白8(Zinctransporter8，ZnT8)，是SLC30家族(ZnTs蛋白)中的一个成员，SLC30家族是负责将细胞内的锌离子转运到细胞外基质或胞内囊泡中。ZnT8特异表达于胰腺组织，且主要位于胰岛β细胞，ZnT8过表达可以通过增加胰岛素分泌通道上的密度进一步使β细胞对葡萄糖刺激所接到的胰岛素分泌增加，从而调节胰岛素的合成，储存和分泌过程。ZnT8自身抗体可能是一种重要的Ⅰ型糖尿病标记物，成为目前诊断试剂的重要补充，ZnT8在TIDM检测中的特异性高达98％，并且在糖尿病检测阴性样本中仍有37.5％阳性率，从而有效避免漏诊发生。ZnT8蛋白以二聚体形式定位于β细胞胰岛素分泌/储存性囊泡膜上调节胞浆和囊泡减的锌转运。ZnT8蛋白单体由369个氨基酸组成，其编码基因SLC30A8全长1100bp，蛋白相对分子量40kD，含有6个跨膜α螺旋(I-VI)，其中第IV和第V结构域之间的环富含组氨酸。蛋白C和N端均位于胞浆中，C端由两个α螺旋(aa284-292、aa327-341)，三个β折叠(aa299-308、aa313-321、aa345-352)组成，其中前两个β折叠构成发卡结构。2004年学者首次从人胰岛细胞中克隆获得了SLC30A8基因，并在HeLa细胞中表达了ZnT8蛋白，但由于ZnT8分子结构复杂，难以在原核系统大量表达，现在利用网织红细胞体外无细胞表达体系制备抗原蛋白的主要方法，但是该方法制备的ZnT8蛋白含量少，成本高昂，制约临床上大规模开展应用。CN102250242A公开了一种特异性表达于胰腺胰岛β细胞的ZnT-8蛋白，涉及编码上述的与胰岛素成熟及外排相关的蛋白质的多核苷酸，并涉及它们的应用，例如在分选及研究β细胞和筛选治疗糖尿病和高胰岛素血症的药物上的应用。但上述现有技术的蛋白表达总量较低，制备过程复杂。目前用于体外合成蛋白质的系统主要有原核表达系统，酵母表达系统，哺乳动物细胞和昆虫细胞表达系统。原核表达系统既是最常用的表达系统，也是最经济实惠的蛋白表达系统。原核表达系统具有遗传背景清楚、成本低、表达量高和表达产物分离纯化相对简单等优点，缺点主要是蛋白质翻译后缺乏加工机制，如二硫键的形成、蛋白糖基化和正确折叠，得到具有生物活性的蛋白的几率较小。酵母蛋白表达系统具有表达量高、可诱导、糖基化机制接近高等真核生物，分泌蛋白易纯化，易实现高密发酵等优点，但蛋白产物易降解，表达量不可控。哺乳动物细胞和昆虫细胞表达系统主要优点是蛋白翻译后加工机制最接近体内的天然形式，最容易保留生物活性，缺点是表达量通常较低，生产成本高。用于捕获自身抗体的抗原蛋白活性直接取决于该抗原蛋白的构象，当ZnT8抗原蛋白的活性与人体内天然ZnT8蛋白构象一致时才能捕获低浓度的ZnT8自身抗体。天然ZnT8蛋白为动物源跨膜蛋白，其分子结构中含有一段富含组氨酸区域，即锌离子的结合位点，包含了6个跨膜区和一个在Ⅳ和Ⅴ区域间的组氨酸环，其中50％的分子嵌埋于磷脂双分子层中，分子结构复杂，难以异源表达。因此，寻找和摸索制备既有天然蛋白的生物活性又能降低生产成本的蛋白表达方法是目前需要解决的技术问题。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术提供一种ZnT8重组蛋白及其制备方法和应用，本专利技术通过分析筛选目的片段、优化编码序列和载体，转染Expi293真核细胞，稳定表达具有抗原活性的蛋白，提供了一种既有天然蛋白的生物活性又能降低生产成本的制备方法，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种ZnT8重组蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。SEQIDNO.1如下：MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAHQRCLGHNHKEVQANASVRAAFVHALGDLFQSISVLISALIIYFKPEYKIADPICTFIFSILVLASTITILKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASRDSQVVRREIAKALSKSFTMHSLTIQMESPVDQDPDCLFCEDPCDGGSHHHHHHDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK.优选地，所述蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。SEQIDNO.2如下：ATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCCCCTGCTGGCGCTGCTGGCCCTCTGGGAACCTGACCCAGCCGCAGCCCACCAGCGGTGCCTGGGCCACAATCACAAAGAGGTGCAGGCCAACGCTTCTGTGCGGGCTGCTTTTGTTCACGCCCTGGGCGATCTGTTCCAGTCCATCTCCGTGCTGATCTCTGCCCTGATCATCTACTTCAAGCCCGAGTACAAGATCGCTGACCCCATCTGCACCTTCATCTTCTCCATCCTGGTGCTGGCCTCTACCATCACAATCCTGAAGGACTTCAGCATCCTGCTGATGGAAGGCGTGCCCAAGAGCCTGAACTACTCCGGCGTGAAAGAACTGATCCTGGCCGTGGATGGCGTGCTGTCTGTGCACTCTCTGCACATCTGGTCCCTGACCATGAATCAAGTGATCCTGAGCGCCCACGTGGCCACCGCTGCTTCTAGAGATTCTCAGGTCGTGCGGAGAGAGATCGCCAAGGCTCTGTCCAAGAGCTTCACCATGCACAGCCTGACCATCCAGATGGAAAGCCCCGTGGATCAGGACCCCGACTGTCTGTTTTGCGAGGACCCTTGCGACGGCGGCTCTCACCACCACCATCACCACGACTACAAGGACCACGACGGCGATTACAAGGATCATGACATCGACTATAAGGACGATGACGACAAGTGA.本专利技术中，专利技术人在长期的科研实践过程中，为研发一种既有天然蛋白的生物活性又能显著降低生产成本的蛋白及制备方法，深入研究目的蛋白的理化特性和蛋白表达的技术方法，广泛分析筛选有效的手段和途径，通过分析筛选目的片段、优化编码序列和载体、选择转染特定的Expi293真核细胞，各步骤各条件协同增效，相互配合，最终实现了稳定表达具有抗原活性的蛋白，提供了一种既有天然蛋白的生物活性又能降低生产成本的制备方法，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。由于ZnT8蛋白为动物源跨膜蛋白，包含了6个跨膜区和一个在Ⅳ和Ⅴ区域间的组氨酸环，其中50％的分子嵌埋于磷脂双分子层中，分子结构复杂，所以很难大量表达并且表达之后难以外排到培养基中，不利于该蛋白质的纯化和应用，因此需要改进该蛋白质表达系统。首先，蛋白质无法外排溶解在培养基中，专利技术人在目的蛋白的编码序列前端串联上一段信号肽编码序列，有助于目的蛋白表达后能穿过细胞膜外排到细胞液中，方便纯化收集；其次，由于蛋白的表达产量低，可以通过优化表达载体来实现，专利技术人在CM本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种ZnT8重组蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种ZnT8重组蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.一种重组质粒，包括表达载体和目的基因，其特征在于，所述目的基因包括权利要求2所述蛋白的核苷酸序列；优选地，所述重组质粒的表达载体的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；优选地，所述重组质粒的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。4.一种重组菌株，其特征在于，所述菌株包括权利要求3所述的重组质粒。5.一种Expi293细胞表达系统，其特征在于，所述表达系统包括权利要求3所述的重组质粒。6.一种如权利要求1或2所述的重组蛋白用于制备免疫印迹试剂盒和/或药物的应用。7.一种制备如权利要求1或2所述ZnT8重组蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)从ZnT8全长基因编码序列中分析筛选初始目的基因序列；(2)在步骤(1)的目的基因N端融合信号肽序列和C端融合标签序列，得到优化后的目的基因；(3)在表达载体pcDNA3.1(+)的CMV启动子下游的多克隆位点两端各添加一个CAG增强子序列，得到优化后的表达载体；(4)合成步骤(2)优化后的目的基因序列和步骤(3)优化后的表达载体序列，构建重组质粒，转化至原核细胞保存；(5)将步骤(4)的重组质粒转染Expi293真核表达系统进行表达，得到所述ZnT8重组蛋白。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述初始目的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；优...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐良，刘尧，林骏，侯建勋，王书晗，王洪涛，林钟石，梁永羿，冼嘉华，黄虹蓉，缪剑虹，山云，刘谦，
申请(专利权)人：深圳市药品检验研究院深圳市医疗器械检测中心，
类型：发明
国别省市：广东,44