一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒及其临床应用制造技术

本发明专利技术涉及一种视黄醇结合蛋白的胶乳增强免疫比浊检测试剂盒，及其在临床检测血清中视黄醇结合蛋白(RBP4)含量的应用，属于医学免疫体外诊断领域。本发明专利技术提供了的RBP胶乳增强免疫比浊检测试剂盒采用重组表达的rhRBP4作为校准品、质控品和相关兔多抗免疫抗原，将上述兔多抗及rhRBP4校准品、质控品用于胶乳增强免疫比浊检测试剂盒的制备中，能够准确检测出血液中RBP4的含量，与市售产品相比，具有更好的特异性和更高的准确度，显现出较好的临床应用前景。且本发明专利技术rhRBP的重组表达方法具有周期短、表达量大、成本低的特点，在很大程度上提高了相关产品的质量均一性。

A Kit for Detecting Retinol Binding Protein and Its Clinical Application

The invention relates to a latex enhanced immunoturbidimetric detection kit for retinol binding protein, and its application in clinical detection of retinol binding protein (RBP4) content in serum, belonging to the field of in vitro diagnosis of medical immunity. The RBP latex enhanced immune turbidimetric test kit provided by the invention uses rhRBP4 recombinant expression as calibrator, quality control product and related rabbit multi-antibody immune antigen. The above-mentioned rabbit multi-antibody and rhRBP4 calibrator and quality control product are used in the preparation of latex enhanced immune turbidimetric test kit, which can accurately detect the content of RBP4 in hemorrhagic fluid, and has better specificity than commercial products. It has good clinical application prospects with higher accuracy. The rhRBP recombinant expression method of the invention has the characteristics of short cycle, large expression amount and low cost, and greatly improves the quality uniformity of the related products.

【技术实现步骤摘要】
一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒及其临床应用
本专利技术属于医学免疫体外诊断领域，尤其是一种重组视黄醇结合蛋白及其在检测血液样本中视黄醇结合蛋白(Retinol-BindingProtein，RBP4)含量的检测试剂盒中的应用。
技术介绍
视黄醇结合蛋白(RBP4)，分子量为21kDa，是血液中维生素A的转运蛋白，广泛分布于血液、脑脊液、尿液及其他体液中。在血液中，RBP4与视黄醇、前白蛋白以1:1:1(摩尔比)的复合物形式存在，转运体内90％的视黄醇至机体组织。当RBP4与细胞表面的RBP受体结合时，视黄醇进入细胞内，复合物解体，游离的RBP4从肾小球滤出，其中绝大部分被近端肾小管上皮细胞重吸收并被分解，供组织利用，仅少量从尿中排出。体内锌、铁缺乏及严重感染等疾病能降低RBP4的生物合成。当肾脏疾病或感染等导致肾小管重吸收功能障碍时，由于肾脏滤过及清除小分子量蛋白的能力下降，使各种形式的RBP4进一步蓄积，导致其在血清中的含量明显增加。因此RBP4测定是诊断早期肾功能损伤和疗效判定的敏感指标。又因RBP4可特异性的反映机体的营养状态，因此也是一项诊断早期营养不良的敏感指标。综上所述，RBP4的定量检测产品将具有重要的临床意义和较强的市场需求。目前临床对RBP4的检测方法主要都是基于免疫学，利用抗原抗体的特异性结合，定量检测血液中RBP4含量，比如酶联免疫吸附测定法、化学发光法、免疫比浊法。随着检测技术的进步以及临床检测需求的增大，前两种方法由于费用高或操作繁琐、周期长等劣势，逐渐淡出临床市场。而伴随着全自动生化分析仪的普及，生化比浊法凭借反应时间短，精密度好，易于自动化等优点，成为临床上主流检测方法。常规的免疫比浊法缺乏级联放大效应，使得灵敏度较低，但是本专利技术采用胶乳增强免疫比浊法，借助包被了特异性兔多抗包被的“胶乳”介质，显著增大抗原抗体反应物的粒径，提高了检测灵敏度和精密度。而其中配套本专利技术的RBP4作为校准品和质控品，以及用以制备抗体的抗原蛋白，在整个产品开发中尤为重要。天然的RBP4获取困难，且质量难以控制。因此，本专利技术考虑采用基因工程途径制备重组RBP4蛋白，基因工程途径主要有原核和真核表达方法。真核表达存在成本比较高，制备工序比较复杂的劣势，导致其不适合用于RBP4的大批量制备。而原核表达相对而言，却比较简单。众所周知，大肠杆菌的遗传背景清楚，培养方法简单，生长周期短，成本低，是一种表达蛋白质的理想工具，但也存在天然编码序列不易克隆的操作困难。
技术实现思路
本专利技术提供了一种重组人视黄醇结合蛋白蛋白(以下简称rhRBP4)，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术提供了编码上述所述rhRBP4的基因，其碱基序列如SEQIDNO：2所示。该序列是专为大肠杆菌表达系统进行密码子优化得到的序列，能够显著提高异源基因在宿主菌中的表达效率。本专利技术还提供了包含了上述所述编码rhRBP4的基因的载体，所述的载体优选为原核表达载体pET21b、pET28a、pTWIN1，特别优选为pET21b作为rhRBP4高效可溶表达的载体。本专利技术还提供了包含有上述所述载体的大肠杆菌宿主菌株，优选地，所述宿主菌株选自大肠杆菌BL21(DE3)或BL21(AI)菌株，特别优选为BL21(DE3)作为rhRBP4高效表达的宿主菌株。本专利技术还提供了rhRBP4在大肠杆菌中高效表达方法，包括如下步骤：1.挑取一个含有上述所述的重组大肠杆菌单菌落，接入LB培养液，于37℃培养过夜；2.取过夜培养物按照1％接种量接入LB培养液中，扩大培养2L，于37℃震荡培养至对数中期(OD600＝0.8～1.0)；3.向培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，于37℃继续诱导表达4-8h，7000rpm，4℃，15min离心收集rhRBP4大肠杆菌菌体沉淀。所述LB培养液中均含氨苄青霉素50-100μg/mL。本专利技术还提供了rhRBP4的包涵体变性和复性方法，包括如下步骤：1.将收集得到的rhRBP4大肠杆菌菌体沉淀，用预冷的20mMPBS缓冲液重悬，至浓度50-100g/L，然后于冰水混合物中预冷10min后，进行超声波裂解破碎，破碎条件为：50％功率(200W)、工作3s间歇4s共30min。超声破碎结束后，12000rpm，4℃，15min，收集裂解物沉淀。2.包涵体洗涤：将上述菌体裂解物沉淀使用200ml20mMPBS+1％TritonX-100，pH7.4,彻底重悬，室温搅拌2h，离心收集沉淀，丢弃上清，沉淀即为洗涤后包涵体。3.包涵体变性：将洗涤后的包涵体沉淀使用200ml变性液(20mMTris8M脲1-10mMDTTpH8-11)彻底重悬，室温搅拌变性2h，离心收集上清，上清使用0.22μm膜过滤，即得到变性液。4.包涵体复性：将上述包涵体变性液使用缓慢加入到2L复性液中(20mMTris3mM还原型谷胱甘肽1mM氧化性谷胱甘肽5％甘油，pH8.0)，加入过程中应快速混匀放置变性液局部浓度过高，变性液加入完毕后，于2-20℃复性40h以上即可。本专利技术还提供了rhRBP4包涵体复性液的纯化方法，包括如下步骤：1.将复性结束的rhRBP4包涵体复性液使用0.22μm膜过滤，然后超滤换液为20mMTrisHCl，pH8.0，换液后再次使用0.22μm膜过滤。2.将换液后的rhRBP4复性液使用Qsepharosehighperformance填料纯化(30ml柱体积)，上样前先使用结合缓冲液平衡柱床，然后上样，上样结束后使用结合缓冲液再平衡柱床至UV和电导率到基线，然后洗脱，洗脱方法为：在10个柱体积内使得经过柱床的洗脱缓冲液比例占50％。3.所述结合缓冲液优选为：20mMTrispH8.0；所述洗脱缓冲液优选为20mMTris1M氯化钠pH8.0，缓冲液配制完成后使用0.22μm膜过滤备用。本专利技术还提供了由上述重组人RBP4作为免疫原制备的兔抗人RBP4多克隆抗体。本专利技术还提供了由上述兔抗人RBP4多克隆抗体制备的胶乳增强免疫比浊检测试剂盒。本专利技术的一种视黄醇结合蛋白免疫胶乳增强比浊检测试剂盒，包含R1试剂、R2试剂和标准品，所述R1试剂包括：缓冲液1、稳定剂、增凝剂、保护剂、防腐剂、螯合剂；所述R2试剂包括：缓冲液2、防腐剂、稳定剂、保护剂；所述标准品包括：缓冲液3、保护剂、稳定剂。优选的，所述R1试剂中：缓冲液为0.01M-0.05M、pH7.0-7.4的磷酸盐缓冲液；稳定剂为40g/L-60g/L的NaCl；增凝剂为0-30g/L的PEG6000，保护剂为10g/L-20g/L的BSA，防腐剂为0.05-0.1g/L的Proclin300，螯合剂为5g/L-10g/L的EDTA。优选的，所述R2试剂中：缓冲液为0.01M-0.05M、pH7.0-7.4的磷酸盐缓冲液；防腐剂为0.1-0.2g/L的Proclin300；稳定剂为10g/L-20g/L的NaCl，和50-100g/L的蔗糖或葡萄糖，保护剂为10g/L-20g/L的BSA；另外有标记有视黄醇结合蛋白抗体的胶乳微球(质量浓度为≤0.1％-0.5％)。优选的，所述标准品包括4支不同浓度的重组人RBP4的溶液，其中：缓冲液为0.01M-0.05M、pH7本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组人视黄醇结合蛋白，其特征在于，所述重组人视黄醇结合蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO：2所示。

【技术特征摘要】
1.一种重组人视黄醇结合蛋白，其特征在于，所述重组人视黄醇结合蛋白的编码基因序列如SEQIDNO：2所示。2.包含了如权利要求1所述编码重组人视黄醇结合蛋白的基因的载体，所述的载体为pET21b。3.包含了如权利要求2所述载体的大肠杆菌宿主菌株，所述宿主菌株选为BL21(DE3)。4.一种重组人视黄醇结合蛋白在大肠杆菌中高效可溶表达方法，包括如下步骤：1).挑取一个含有如权利要求3所述的重组大肠杆菌单菌落，接入LB培养液，培养过夜；2).取过夜培养物接入LB培养液中，震荡培养至对数中期(OD600＝0.8～1.0)；3).在培养物中加入IPTG至0.5mmol/L，诱导表达，离心收集含有重组人视黄醇结合蛋白的大肠杆菌菌体沉淀；4).将收集得到的菌体沉淀离心、破碎后，以QHP柱纯化得到纯重组人视黄醇结合蛋白样品。5.一种兔抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体，其特征在于，所述抗体用权利要求1所述的重组人视黄醇结合蛋白作为免疫原制备的得到。6.一种检测人视黄醇结合蛋白含量的胶乳增强免疫比浊检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1的重组人视黄醇结合蛋白、如权利要求5所述的兔抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体。7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含R1试剂、R2试剂和标准品，所述R1试剂包括：缓冲液1、稳定剂、增凝剂、保护剂、防腐剂、螯合剂；所述R2试剂包括：缓冲液2、防腐剂、稳定剂、保护剂；所述标准品包括：缓冲液3、保护剂、稳定剂。8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中：缓冲液1为0.01M-0...

【专利技术属性】
技术研发人员：马永，杨芸，赵利利，赵百学，
申请(专利权)人：江苏众红生物工程创药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32