本发明专利技术涉及生物技术领域，具体公开一种采用胶乳免疫比浊法检测视黄醇结合蛋白含量的试剂盒。本发明专利技术所述试剂盒包含试剂R1、试剂R2、校准品；所述试剂R1为pH值6-9的缓冲液，所述试剂R2为抗视黄醇结合蛋白的双抗体包被的胶乳试剂，所述校准品是pH值5-8的视黄醇结合蛋白溶液。本发明专利技术所述试剂盒采用胶乳免疫比浊法检测样品中视黄醇结合蛋白含量，灵敏度高，可达到0.042mg/L；稳定性好，操作简单、快速；特异性强，不易受干扰；定量准确，具有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，特别涉及应用双抗体制备胶乳免疫试剂用胶乳免疫比浊法进行视黄醇结合蛋白检测的试剂盒。
技术介绍
视黄醇结合蛋白(retinol binding protein, RBP)是单一肽链蛋白质，分子量约21kD，有一个位点特异结合一分子全反式视黄醇，即维生素A。视黄醇结合蛋白根据序列同源性分为5类分泌型RBP、细胞内RBP、视黄酸的核受体、视觉组织特异性的细胞外RBP和视觉组织特异性的细胞内RBP。血清RBP4为分泌型RBP，是细胞外最主要的转运蛋白，负责结合、转运血液中的视黄醇。 视黄醇结合蛋白是血液中维生素的转运蛋白，由肝脏合成，广泛分布于人体血清、脑脊液、尿液及其他体液中，但脂肪组织中的视黄醇结合蛋白仍占其合成量的15% 30%，机体约20%的视黄醇存储在脂肪组织。在血液循环中RBP与视黄醇、甲状腺素运载蛋白(TTR)以I : I : I形成高分子蛋白复合物，其生物学作用是将视黄醇从肝细胞转运到靶组织，以及实现VitA的细胞内转运代谢。血清中视黄醇结合蛋白正常值是男36 56mg/L (36. O 56. O μ g/ml)、女:26. 7 57. 9mg/L(26. 7 57. 9 μ g/ml)。体内90%RBP与视黄醇结合，形成视黄醇、视黄醇结合蛋白和甲状腺素的高分子复合物，不能被肾小球滤出，而10%游离状态的RBP则会经肾小球滤出，99. 97%由近端小管上皮细胞重吸收，并被分解成氨基酸，供体内合成利用，仅有少量从尿中排泄。健康人尿中含量极低，小于O. 7mg/L。当肾小管重吸收障碍时，尿RBP排出增多，目前认为是反映近端肾小管功能的一项较好的标志物。近年来研究显示尿RBP含量与肾小管间质受损有较好的相关性，并认为肾小管间质病变较肾小球病变更早引起肾功能损伤，30%以上的肾小球疾病伴有肾小管间质病变，在这种情况下可能进展为肾功能衰竭。故尿RBP测定对肾小管间质病变在进行性肾小球受损中的重要性受到越来越多国内外学者的重视。肾病早期肾损伤时常无任何临床表现，常规检查尿蛋白多为阴性，血清尿素氮与C r作为传统反映肾脏功能的指标，两者的灵敏性较差。因为肾小球的代偿能力很强，只有当50%以上的肾小球受损时才会引起两者的升高。国外报道在高血压病肾损害的早期诊断中，RBP较β 2 — MG、mAlb更灵敏。在糖尿病肾病早期，尿RBP4排泄增加先于微白蛋白尿出现，被认为是反映早期肾损害的标志。尿RBP检测是评价肾功能早期损伤的良好指标，具有较好的临床应用价值。目前检测尿RBP的方法，由最初的免疫电泳的定性检测，到有单向免疫扩散RID、酶联免疫吸附EIA、荧光免疫的定量检测，以及到免疫比浊的自动化检测，发展十分迅速。目前临床进行大量样本检测常采用的方法是免疫比浊法。目前临床上进行大量样本检测的方法是免疫透射比浊法和免疫散射比浊法。免疫比浊法是抗原抗体结合动态测定方法。其基本原理是当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应而且比例合适(一般规定抗体过量)时，形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中的促聚齐IJ(聚乙二醇等)的作用下，自液相析出，形成微粒，使反应液出现浊度。当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增加。通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可计算出检样中抗原的含量。但是当抗原量很低时，抗原抗体结合物较少，形成的浊度低，不易被检测，从而造成灵敏度低。胶乳增强免疫比浊法则是将抗体标记在胶乳颗粒上，当抗原抗体反应时，形成的结合物将胶乳包含在内，从而放大浊度效应，易于被检测到。目前市场上有多种免疫透射比浊方法的试剂盒，可以同时检测血清和尿液的RBP浓度，但因为健康人血清RBP浓度是26. 7 68. 6mg/L，尿中RBP浓度小于O. 7mg/L,试剂盒的线性范围宽检测限10 140mg/L，导致在测定尿液RBP低浓度时，都存在灵敏度不足的问题。因此选择合适的线性范围，研制能够准确、灵敏进行尿液RBP浓度测定的试剂盒，具有很大的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服目前现有RBP检测试剂盒的不足，提供一种灵敏度高的检测RBP的胶乳增强免疫比浊试剂盒。为实现本专利技术的目的，本专利技术提供一种采用胶乳免疫比浊法检测视黄醇结合蛋白含量的试剂盒，包含试剂R1、试剂R2、校准品；所述试剂Rl为pH值6-9的缓冲液，所述试剂R2为抗视黄醇结合蛋白的双抗体包被的胶乳试剂，所述校准品是pH值5-8的视黄醇结合蛋白溶液。所述试剂R2中双抗体是配对的一株单克隆抗体和一种多克隆抗体，单克隆抗体亲和力高，与RBP先结合，起到捕获作用，多克隆抗体含多株可结合RBP不同表位的抗体，起检测功能。单克隆抗体选自鼠抗人、兔抗人抗体，优选地，选自鼠抗人单克隆抗体；多克隆抗体选自鼠抗人、兔抗人、羊抗人抗体，优选地，选自兔抗人多克隆抗体。优选地，试剂I、试剂2、校准品溶液的缓冲液选自Tris/HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液、巴比妥缓冲液、MOPSO缓冲液、DIPSO缓冲液、HEPPS缓冲液中的一种，试剂Rl的PH范围为6-9 ;试剂R2的pH范围是6_8 ;校准品的pH范围是5_8，优选为5. 9-6. I。优选地，试剂Rl 含有 O. 7%-0. 9% 的 NaCl、l%_6% 的 PEG 6000、O. 01%_0· 1% 的Tween80o优选地，试剂R2中，选用的视黄醇结合蛋白抗体浓度为O. 1-lmg/ml，是配对的一株视黄醇结合蛋白单克隆抗体和一种视黄醇结合蛋白多克隆抗体。单克隆抗体选自鼠抗人或兔抗人单克隆抗体，优选鼠单克隆抗体；多克隆抗体选自鼠抗人、兔抗人或羊抗人多克隆抗体，优选兔抗人多克隆抗体。所述试剂R2由以下方法制备将抗视黄醇结合蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体按重量比1:1-4:1混合均匀后与胶乳颗粒充分孵育，加封闭液封闭，离心去上清，用Tris/HCl缓冲液分散至胶乳颗粒浓度至2mg/ml。单克隆抗体和多克隆抗体优选的比例是I.5:1-3 :1，更优选地，制备试剂R2选用的胶乳颗粒是疏水性胶乳颗粒聚乙烯基苄基氯胶乳，采用化学交联的方法将抗体标记于胶乳颗粒上，胶乳颗粒的粒径范围为50-250nm，优选60_140nm。聚乙烯基苄基氯胶乳颗粒是一种核壳形式的胶乳颗粒，其胶乳核是甲苯乙烯聚合物，胶乳壳为乙烯基苄基氯的聚合物，是一种疏水性胶乳。在壳的表面具有氯甲基活性基团，这些活性基团可以在温和的水溶液中直接与抗体、抗原或其他配体的氨基基团反应，通过一步反应产生一种稳定的共价化合物。在本专利技术的具体实施方式中，标准品视黄醇结合蛋白溶液浓度分别为8mg/L、4mg/L、2mg/L、lmg/L、0. 5mg/L、0mg/L。校准品的pH范围是5-8,健康人尿液的pH值在6左右,故优选为5. 9-6. I优选地，本专利技术所述试剂盒中含有稳定剂和防腐剂。所述稳定剂选自蛋白质、氨基酸、无机盐、表面活性剂、助悬剂或抗氧剂中的一种或多种；所述的防腐剂选自O. 1%的叠氮钠、Proclin 300或庆大霉素。 本专利技术测定样本的原理是胶乳增强免疫比浊法，所选样本为人体尿液，样本与试剂Rl (pH值为6-9的缓冲液)预孵育35分钟后(使样本中的抗体结合位点充分本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种采用胶乳比浊法检测视黄醇结合蛋白含量的试剂盒，包含试剂R1、试剂R2、校准品；所述试剂R1为pH值6?9的缓冲液，所述试剂R2为抗视黄醇结合蛋白的双抗体包被的胶乳试剂，所述校准品是pH值5?8的视黄醇结合蛋白溶液。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张英伟，
申请(专利权)人：北京康美天鸿生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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