人Agrin抗原、人Agrin抗体检测试剂盒及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了人Agrin抗原、ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用。所述人Agrin抗原包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，还提供了七种分别含有上述七种人Agrin的抗原的检测试剂盒，以及1种同时含有上述七种人Agrin抗原的检测试剂盒。该人Agrin检测试剂盒，检测人血清中的Agrin抗体，特异性强，反应灵敏度高，高通量、成本低，能够对对重症肌无力病症进行诊断，适于大规模推广应用。

Detection Kit of Human Agrin Antigen and Human Agrin Antibody and Its Preparation and Application

The invention provides human Agrin antigen, ELISA detection kit, preparation method and application. The human Agrin antigen includes the amino acid sequences shown in SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 and SEQ ID NO:7. Seven test kits containing the seven human Agrin antigens and one test kit containing the seven human Agrin antigens at the same time are also provided. The human Agrin detection kit has strong specificity, high sensitivity, high throughput and low cost. It can diagnose myasthenia gravis and is suitable for large-scale application.

【技术实现步骤摘要】
人Agrin抗原、人Agrin抗体检测试剂盒及其制备方法与应用
本专利技术涉及生物制药
，尤其涉及人Agrin抗原、人Agrin抗体检测试剂盒及其制备方法与应用。
技术介绍
重症肌无力(Myastheniagravis，MG)，是常见的肌肉神经接头(neuromuscularjunction，NMJ)疾病。在大多数患者中，MG可能来自一个对乙酰胆碱受体(AChRs)的自身免疫反应，能够在80％-85％的MG患者中检测到AChRs的自身抗体。然而，AChR抗体在大约20％的MG患者中没有被检测到。有证据表明，这些“血清反应阴性”的患者可以产生对NMJ形成或保持非常关键的蛋白抗体。从运动神经元释放的聚集蛋白Agrin，结合到低密度脂蛋白受体相关的蛋白4(LRP4)，激活受体酪氨酸激酶MuSK来指导NMJ的形成。大约40％-70％的血清反应阴性患者有MuSK自身抗体。其余6％-12％的MG患者对AChR和MuSK抗体具有双血清阴性反应。聚集蛋白Agrin是从运动神经终端释放出来的硫酸类肝素蛋白多糖。其调节神经肌肉接点的形成、维持和再生，并且干扰聚集蛋白功能，可导致神经肌肉传递不足在少数MG病人中聚集蛋白抗体可以在有或者没有针对AChR，MuSK或者LRP4抗体的情况下被检测出来。聚集蛋白抗体只有在MG病人中可以被检测出来，提示这些抗体对于MG来说是特异性的。目前还没有人Agrin抗体检测试剂盒的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种人Agrin抗原及其制备方法、人Agrin抗体检测试剂盒及其制备方法与应用，该检测试剂盒能特异性检测人血清中的LRP4抗体，对重症肌无力有诊断意义，反应灵敏，成本低、适于大规模推广应用。本专利技术是这样实现的：本专利技术的目的之一在于一种人Agrin抗原，包括以下任意一种片段或者七种片段：片段1：Agrin-40，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；片段2：Agrin-411，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；片段3：Agrin-701，氨基酸序列如SEQIDNO.3所示；片段4：Agrin-1103，氨基酸序列如SEQIDNO.4所示；片段5：Agrin-1281，氨基酸序列如SEQIDNO.5所示；片段6：Agrin-1635，氨基酸序列如SEQIDNO.6所示；片段7：Agrin-1864，氨基酸序列如SEQIDNO.7所示。本专利技术的目的之二在于提供人Agrin抗原的制备方法，包括如下步骤：步骤1、将Agrin-40、Agrin-411、Agrin-701、Agrin-1103、Agrin-1281、Agrin-1635和Agrin-1864的7个片段的DNA序列分别进行基因合成，设计引物PCR扩增后，分别连接进表达载体，构建重组表达质粒；步骤2、将构建好的重组质粒转化进入表达菌，构建重组表达工程菌；步骤3、人Agrin抗原的诱导表达及纯化。具体地，所述步骤1中所述7个片段的引物对分别为：Agrin-40-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.8所示；Agrin-40-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；Agrin-411-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.10所示；Agrin-411-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.11所示；Agrin-701-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；Agrin-701-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.13所示；Agrin-1103-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.14所示；Agrin-1103-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.15所示；Agrin-1281-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.16所示；Agrin-1281-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.17所示；Agrin-1635-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.18所示；Agrin-1635-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.19所示；Agrin-1864-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.20所示；Agrin-1864-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.21所示。具体地，所述步骤1中PCR扩增的反应体系为：H2O38.7ul；Buffer5ul；dNTP3ul；上引物1ul；下引物1ul；DNA1ul；TaqE0.3ul；扩增程序为：94度变性5min；94度变性45sec、57度150sec、72度90sec，32个循环；72度延伸10min。具体地，所述步骤3中诱导表达的具体步骤为：将7个重组菌分别接种于LB培养液中摇菌至OD600至0.6-0.8时，按1:1000加入24mg/ml浓度的IPTG诱导4-6小时。具体地，所述步骤3中诱导表达后的纯化条件是：上样缓冲液：0.5MNaCl、20mMNa2HPO3、10mM咪唑；结合缓冲液：0.5MNaCl、20mMNa2HPO3、20mM咪唑；洗脱缓冲液：0.5MNacl、20mMNa2HPO3、500mM咪唑。本专利技术的目的之三在于提供一种人Agrin抗原的表达载体，所述表达载体为7个，所述7个表达载体的表达区的核苷酸序列分别为：如SEQIDNO.22、SEQIDNO.23、SEQIDNO.24、SEQIDNO.25、SEQIDNO.26、SEQIDNO.27、SEQIDNO.28所示。本专利技术的目的之四在于提供一种人Agrin抗原的表达工程菌，该工程菌为7个，所述7个工程菌分别包含所述7个人Agrin抗原的表达载体。本专利技术的目的之五在于提供人Agrin抗体检测试剂盒，所述的ELISA检测试剂盒包括：(A)包被有所述的人Agrin抗原的ELISA酶标板；所述人Agrin抗原包括Agrin-40、Agrin-411、Agrin-701、Agrin-1103、Agrin-1281、Agrin-1635和Agrin-1864中的任意一种或者七种；(B)标准阴性血清：Agrin抗体阴性的血清；(C)标准阳性血清：Agrin抗体阳性的血清；(D)辣根过氧化物酶标记的酶标二抗：抗人IGG、IGM和IGA；(E)样品稀释液、包被缓冲液、封闭液、ELISA酶标板洗涤液、抗体稀释液、显色液和终止液。其中，所述人Agrin抗原Agrin-40、Agrin-411、Agrin-701、Agrin-1103、Agrin-1281、Agrin-1635和Agrin-1864的包被浓度分别为200ng/ml、200ng/ml、250ng/ml、250ng/ml、300ng/ml、150ng/ml和150ng/ml。本专利技术的目的之六在于提供人Agrin抗体的检测方法，所述的检测方法包括以下步骤：S1、制备检测ELISA酶标板：包被缓冲液将权利要求1所述的人Agrin抗原稀释后加到酶标板中吸附，空干包被用洗液，加包被用封闭液封闭；所述人Agrin抗原包括Agrin-40、Agrin-411、Agrin-701、Agrin-1103、Agrin-1281、Agrin-1635和Agrin-1864中的任意一种或者七种；S2、待检血清、阴性血清、阳性血清分别作为一抗，加样至ELISA酶标板孔中进行孵育；S3、酶标二抗的孵育：辣根过氧化物酶标记的酶标二抗加入ELISA酶标板，洗涤液洗涤，甩干；S4、加入显色液，室本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人Agrin抗原，其特征在于，包括以下任意一种片段或者七种片段：片段1：Agrin‑40，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；片段2：Agrin‑411，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；片段3：Agrin‑701，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；片段4：Agrin‑1103，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；片段5：Agrin‑1281，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；片段6：Agrin‑1635，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；片段7：Agrin‑1864，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

【技术特征摘要】
1.一种人Agrin抗原，其特征在于，包括以下任意一种片段或者七种片段：片段1：Agrin-40，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；片段2：Agrin-411，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；片段3：Agrin-701，氨基酸序列如SEQIDNO.3所示；片段4：Agrin-1103，氨基酸序列如SEQIDNO.4所示；片段5：Agrin-1281，氨基酸序列如SEQIDNO.5所示；片段6：Agrin-1635，氨基酸序列如SEQIDNO.6所示；片段7：Agrin-1864，氨基酸序列如SEQIDNO.7所示。2.一种权利要求1所述的人Agrin抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、将Agrin-40、Agrin-411、Agrin-701、Agrin-1103、Agrin-1281、Agrin-1635和Agrin-1864共7个片段的DNA序列分别进行基因合成，设计引物PCR扩增后，分别连接进表达载体，构建7个重组表达质粒；步骤2、将构建好的重组质粒分别转化进入表达菌，构建7个重组表达工程菌；步骤3、Agrin-40、Agrin-411、Agrin-701、Agrin-1103、Agrin-1281、Agrin-1635和Agrin-1864的抗原片段的诱导表达及纯化。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中所述7个片段的引物对分别为：Agrin-40-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.8所示；Agrin-40-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；Agrin-411-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.10所示；Agrin-411-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.11所示；Agrin-701-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；Agrin-701-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.13所示；Agrin-1103-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.14所示；Agrin-1103-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.15所示；Agrin-1281-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.16所示；Agrin-1281-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.17所示；Agrin-1635-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.18所示；Agrin-1635-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.19所示；Agrin-1864-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.20所示；Agrin-1864-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.21所示。4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中PCR扩增的反应体系为：H2O38.7ul；Buffer5ul；dNTP3ul；上引物1ul；下引物1ul；DNA1ul；TaqE0.3ul；扩增程序为：94度变性5min；94度变性45sec、57度150sec、72度90sec，32个循环；72度延伸10min。5.如权利要求2所述的制...

【专利技术属性】
技术研发人员：张崇珍，王颖，郝洪军，
申请(专利权)人：武汉明德生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42