人CNTN1抗原、人CNTN1抗体检测试剂盒及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了人CNTN1抗原、ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用。人CNTN1抗原包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，还提供了四种分别含有上述四种人CNTN1的抗原的检测试剂盒，以及一种同时含有上述四种人CNTN1抗原的检测试剂盒。该人CNTN1检测试剂盒，检测人血清中的CNTN1抗体，特异性强，反应灵敏度高，高通量、成本低，能够对慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病(CIDP)进行诊断，适于大规模推广应用。

Detection Kit of Human CNTN1 Antigen and Human CNTN1 Antibody and Its Preparation and Application

The invention provides human CNTN1 antigen, ELISA detection kit, preparation method and application. The human CNTN1 antigen includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 and SEQ ID NO:4. Four test kits containing the above four human CNTN1 antigens and one test kit containing both the above four human CNTN1 antigens are also provided. The human CNTN1 detection kit has strong specificity, high sensitivity, high throughput and low cost. It can diagnose chronic inflammatory demyelinating polyradicular neuropathy (CIDP) and is suitable for wide application.

【技术实现步骤摘要】
人CNTN1抗原、人CNTN1抗体检测试剂盒及其制备方法与应用
本专利技术涉及生物制药
，尤其涉及人CNTN1抗原、人CNTN1抗体检测试剂盒及其制备方法与应用。
技术介绍
慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病(CIDP)是以周围神经近端慢性脱髓鞘为主要病变的自身免疫性运动感觉性周围神经病，属于慢性获得性脱髓鞘性多发性神经病(ADP)，是CADP最常见的一种类型，呈慢性进展或缓解-复发病程。近年来，结区/结旁区相关抗体是CIDP领域研究的热点。CNTN1(接触蛋白1)是位于郎飞氏结旁区的一种蛋白质，对于维持郎飞氏结旁的轴突胶质联结和保持郎飞氏结的神经信号跳跃性传导有重要作用。研究表明，30％的CIDP患者血清中的IgG抗体会与结区、结旁区结构结合，参与CIDP的病理生理机制。此外，结区/结旁区抗体阳性的患者具有特征性的临床表现和特殊的治疗选择。目前还没有人CNTN1抗体检测试剂盒的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种人CNTN1抗原及其制备方法、人CNTN1抗体检测试剂盒及其制备方法与应用，该试剂盒具有较高灵敏度和特异性，对慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病(CIDP)的检测有重要价值。本专利技术是这样实现的：本专利技术的目的之一在于一种人CNTN1抗原，包括以下任意一种片段或者四种片段：片段1：CNTN1-39，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；片段2：CNTN1-322，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；片段3：CNTN1-609，氨基酸序列如SEQIDNO.3所示；片段4：CNTN1-809，氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术的目的之二在于提供人CNTN1抗原的制备方法，包括如下步骤：步骤1、将CNTN1-39、CNTN1-322、CNTN1-609、CNTN1-809的4个片段的DNA序列分别进行基因合成，设计引物PCR扩增后，分别连接进表达载体，构建4个重组表达质粒；步骤2、将构建好的重组质粒转化分别进入表达菌，构建4个重组表达工程菌；步骤3、CNTN1-39、CNTN1-322、CNTN1-609、CNTN1-809的的诱导表达及纯化。具体地，所述步骤1中所述4个片段的引物对分别为：CNTN1-39-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；CNTN1-39-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；CNTN1-322-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；CNTN1-322-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.8所示；CNTN1-609-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；CNTN1-609-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.10所示；CNTN1-809-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.11所示；CNTN1-809-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.12所示。具体地，所述步骤1中PCR扩增的反应体系为：H2O38.7ul；Buffer5ul；dNTP3ul；上引物1ul；下引物1ul；DNA1ul；TaqE0.3ul；扩增程序为：94度变性5min；94度变性45sec、57度150sec、72度90sec，32个循环；72度延伸10min。具体地，所述步骤3中诱导表达的具体步骤为：将4个重组菌分别接种于LB培养液中摇菌至OD600至0.6-0.8时，按1:1000加入24mg/ml浓度的IPTG诱导4-6小时。具体地，所述步骤3中诱导表达后的纯化条件是：上样缓冲液：0.5MNaCl、20mMNa2HPO3、10mM咪唑；或者上样缓冲液：8M尿素、0.5MNaCl、20mMNa2HPO3、10mM咪唑；结合缓冲液：0.5MNaCl、20mMNa2HPO3、20mM咪唑；洗脱缓冲液：0.5MNaCl、20mMNa2HPO3、500mM咪唑。本专利技术的目的之三在于所述表达载体为4个，所述4个表达载体的表达区的核苷酸序列分别为：如SEQIDNO.13、SEQIDNO.14、SEQIDNO.15、SEQIDNO.16所示。本专利技术的目的之四在于提供一种人CNTN1抗原的表达工程菌，该工程菌为4个，所述4个工程菌分别包含所述4个人CNTN1抗原的表达载体。本专利技术的目的之五在于提供人CNTN1抗体检测试剂盒，所述的ELISA检测试剂盒包括：(A)包被所述的人CNTN1抗原的ELISA酶标板；所述人CNTN1抗原包括CNTN1-39、CNTN1-322、CNTN1-609、CNTN1-809中的任意一种或者四种；(B)标准阴性血清：CNTN1抗体阴性的血清；(C)标准阳性血清：CNTN1抗体阳性的血清；(D)辣根过氧化物酶标记的酶标二抗：抗人IGG、IGM和IGA；(E)样品稀释液、包被缓冲液、封闭液、ELISA酶标板洗涤液、抗体稀释液、显色液和终止液。其中，所述人CNTN1抗原中CNTN1-39、CNTN1-322、CNTN1-609和CNTN1-809片段的最优包被浓度分别为200ng/ml、200ng/ml、250ng/ml和150ng/ml。本专利技术的目的之六在于提供人CNTN1抗体的检测方法，所述的检测方法包括以下步骤：(1)制备检测ELISA酶标板：包被缓冲液将所述的人CNTN1抗原稀释后加到酶标板中吸附，空干包被用洗液，加包被用封闭液封闭；所述人CNTN1抗原包括CNTN1-39、CNTN1-322、CNTN1-609、CNTN1-809中的任意一种或者四种；(2)待检血清、阴性血清、阳性血清分别作为一抗，加样至ELISA酶标板孔中进行孵育；(3)酶标二抗的孵育：辣根过氧化物酶标记的酶标二抗加入ELISA酶标板，洗涤液洗涤，甩干；(4)加入显色液，室温避光孵育，加入终止液终止反应；在酶标仪上450nm波长下测定OD值。本专利技术的目的之七在于提供所述的ELISA检测试剂盒在诊断慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病中的应用。本专利技术具有的有益效果是：本专利技术提供了人CNTN1抗原、人CNTN1抗体检测试剂盒及检测方法，首先制备得到人CNTN1抗原(CNTN1-39，CNTN1-322，CNTN1-609，CNTN1-809中任意一种或多种)，然后以人CNTN1抗原为包被抗原对样本血清进行间接ELISA检测，该试剂盒可以用于检测诊断慢性炎性脱髓性多发性神经炎神经病CIDP，特异性强，灵敏度高，稳定性好。附图说明图1为本专利技术实施例1提供的构建的重组质粒的酶切图；其中，(A)为包含CNTN1-39的重组质粒的酶切图；(B)为包含CNTN1-322的重组质粒的酶切图；(C)为包含CNTN1-609的重组质粒的酶切图；(D)为包含CNTN1-809的重组质粒的酶切图；其中1泳道为未酶切的质粒，2泳道为经相应的内切酶酶切的条带；(E)为Marker条带图，该Marker为1Kbladder；图2为本专利技术实施例2提供的CNTN1-39、CNTN1-322、CNTN1-609、CNTN1-809片段的纯化产物电泳图。具体实施方式实施例1构建重组表达质粒以及工程菌1、接触蛋白是免疫球蛋白超家族中的一个亚群,其成员包括CNTN1、CNTN2、CNTN3、CNTN4、CNTN5和CNTN6。接触蛋白CNTN1是第一个被识别的接触蛋白成员,基因位于染色体12q11-q1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人CNTN1抗原，其特征在于，包括以下任意一种片段或者四种片段：片段1：CNTN1‑39，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；片段2：CNTN1‑322，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；片段3：CNTN1‑609，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；片段4：CNTN1‑809，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

【技术特征摘要】
1.一种人CNTN1抗原，其特征在于，包括以下任意一种片段或者四种片段：片段1：CNTN1-39，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；片段2：CNTN1-322，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；片段3：CNTN1-609，氨基酸序列如SEQIDNO.3所示；片段4：CNTN1-809，氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。2.一种权利要求1所述的人CNTN1抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、将CNTN1-39、CNTN1-322、CNTN1-609、CNTN1-809的4个片段的DNA序列分别进行基因合成，设计引物PCR扩增后，分别连接进表达载体，构建4个重组表达质粒；步骤2、将构建好的重组质粒分别转化进入表达菌，构建4个重组表达工程菌；步骤3、CNTN1-39、CNTN1-322、CNTN1-609、CNTN1-809的抗原片段的诱导表达及纯化。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中所述4个片段的引物对分别为：CNTN1-39-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；CNTN1-39-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；CNTN1-322-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；CNTN1-322-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.8所示；CNTN1-609-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；CNTN1-609-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.10所示；CNTN1-809-P1：核苷酸序列如SEQIDNO.11所示；CNTN1-809-P2：核苷酸序列如SEQIDNO.12所示。4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中PCR扩增的反应体系为：H2O38.7ul；Buffer5ul；dNTP3ul；上引物1ul；下引物1ul；DNA1ul；TaqE0.3ul；扩增程序为：94度变性5min；94度变性45sec、57度150sec、72度90sec，32个循环；72度延伸10min。5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3中诱导表达的具体步骤为：将4个重组菌分别接种于LB培养液中摇菌至OD600至0.6-0.8时，按1:1000加入24mg/...

【专利技术属性】
技术研发人员：王颖，张崇珍，郝洪军，
申请(专利权)人：武汉明德生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42