一种脐带膜保存和制备干细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种从人脐带最外表面覆盖的羊膜层制备间充质干细胞的方法，分离培养时脐带膜不需要贴壁处理，所分离的间充质干细胞比普通华通氏胶组织块贴壁法纯度更高。华通氏胶含有一定的成纤维细胞，其特性与间充质干细胞非常类似，难以纯化。人羊膜只含有人羊膜上皮细胞和人羊膜间充质干细胞两种细胞类型，上皮细胞贴壁能力强，传代培养过程中容易去掉，从而获得的间充质干细胞纯度更高。本发明专利技术从脐带最外表面覆盖的羊膜层中提取间充质干干细胞，可有效的对脐带组织进行长期冷冻保存，冻存液充分接触脐带膜，最大程度维持了脐带膜两侧细胞的活性，且方便复苏使用，尤其是复苏后分离间充质干细胞，不需要脐带膜组织块的贴壁处理。

A method for preservation and preparation of stem cells from umbilical cord membrane

The invention relates to a method for preparing mesenchymal stem cells from the amniotic membrane covering the outermost surface of human umbilical cord. The umbilical cord membrane does not need adherence treatment when it is isolated and cultured, and the purity of the separated mesenchymal stem cells is higher than that of ordinary Walton's glue tissue block adherence method. Walton's gum contains fibroblasts, which are very similar to mesenchymal stem cells and difficult to purify. Human amniotic membrane contains only human amniotic epithelial cells and human amniotic mesenchymal stem cells, which have strong adherence ability and can be easily removed in the process of subculture, thus obtaining more pure mesenchymal stem cells. The invention extracts mesenchymal stem cells from the amniotic membrane layer covered by the outermost surface of the umbilical cord, which can effectively freeze and preserve the umbilical cord tissue for a long time. The cryopreservation fluid contacts the umbilical cord membrane sufficiently, maintains the activity of the cells on both sides of the umbilical cord membrane to the greatest extent, and is convenient for resuscitation and use, especially for separating the mesenchymal stem cells after resuscitation, and does not need adherence treatment of the umbili

【技术实现步骤摘要】
一种脐带膜保存和制备干细胞的方法
本专利技术属于干细胞制备
，具体涉及一种人脐带来源间充质干细胞的制备方法，尤其涉及从脐带最外层羊膜中分离间充质干细胞。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)起源于发育早期的中胚层,是一类具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞。MSCs具有免疫原性低、造血支持、炎症趋化、免疫调节和提供营养支持等生物学特性，在组织损伤，免疫调控和再生医学领域受到了广泛的研究，具有广阔的应用前景。间充质干细胞具有很强的分化能力，除可分化为脂肪，骨、软骨、骨骼肌和肌腱等中胚层细胞外，无论体内还是体外，在不同的诱导条件下，间充质干细胞还可分化为外胚层的神经细胞和内胚层的肝卵圆性细胞。临床试验表明，间充质干细胞可归巢到组织损伤部位，参与多种组织的损伤修复。间充质干细胞对固有免疫系统和获得性免疫系统的多种免疫细胞都可以进行免疫调节。间充质干细胞主要通过旁分泌产生细胞因子、趋化因子和生长因子等生物活性物质以及细胞与细胞间的直接接触等方式共同对靶细胞进行免疫调控，调控的细胞类型包括巨噬细胞，天然杀伤细胞，T细胞，B细胞，树突状细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脐带膜保存和制备干细胞的方法，包括以下步骤：（1）脐带膜的处理和冷冻保存方法：1）脐带的采集：经产妇知情同意，在产房无菌条件下，健康产妇胎儿娩出后即刻按产科常规结扎断脐的方法截取不少于20cm长的脐带，用脐带清洗液冲洗脐带，再用医用酒精消毒，将脐带置于脐带保存盒中于2‑8℃医用取血箱恒温保存，从母体抽取4ml外周血，用于病毒检测；从胎盘端抽取4ml脐带血，用于微生物检测；2）脐带的运输和接收：将母血检测样本、脐带血检测样本和装有脐带的保存盒通过冷链运输送达生物样本库的实验室，为最大限度保证细胞的活性，样本入库时间越短越好，所有样本要在48h内入库，实验室接收样本后，将脐带血和母血检测样...

【技术特征摘要】
1.一种脐带膜保存和制备干细胞的方法，包括以下步骤：（1）脐带膜的处理和冷冻保存方法：1）脐带的采集：经产妇知情同意，在产房无菌条件下，健康产妇胎儿娩出后即刻按产科常规结扎断脐的方法截取不少于20cm长的脐带，用脐带清洗液冲洗脐带，再用医用酒精消毒，将脐带置于脐带保存盒中于2-8℃医用取血箱恒温保存，从母体抽取4ml外周血，用于病毒检测；从胎盘端抽取4ml脐带血，用于微生物检测；2）脐带的运输和接收：将母血检测样本、脐带血检测样本和装有脐带的保存盒通过冷链运输送达生物样本库的实验室，为最大限度保证细胞的活性，样本入库时间越短越好，所有样本要在48h内入库，实验室接收样本后，将脐带血和母血检测样本移交质控实验室进行微生物检测和病毒检测；3）脐带膜的制备：待步骤2）中脐带血和母血检测样本检测合格后，将脐带移交至制备实验室，进行脐带膜的分离制备，脐带首先用75%的酒精进行消毒，然后用基础平衡盐溶液反复冲洗表面；用手术刀将脐带切成2~3cm的小段，用钝性镊子剥离脐带血管后，手术刀片刮去脐带羊膜下层的华通氏胶，将脐带膜切成0.5cm×0.5cm的片状；4）脐带膜的冻存：步骤3）中制备好的脐带膜，浸入2-8℃预冷的冻存保护液中，脐带膜和冻存液按1:1的体积比装入冻存管中，将冻存管放入程控降温仪进行预冷，开始冻存程序，将温度降至-90℃后取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存；（2）脐带膜复苏分离提取间充质干细胞：5）脐带膜的复苏：将装有脐带膜的冻存管从液氮中取出后，置于37℃水浴锅中解冻2-5分钟，将脐带膜用复苏清洗液洗涤2-4次后接种至含有完全培养基的六孔板中；6）间充质干细胞的原代培养：将接种脐带膜组织片的六孔板置于37℃、含5%的CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，培养5天后首次进行半量换液，之后每3天换液一次，7-12天左右培养板底部可观察到有细胞贴壁生长；7）传代培养：待原代细胞生长至细胞融合度80-90%后用含0.05~0.25%的胰蛋白酶进行消化，消化液经100目滤网过滤，去掉脐带组织片，获得含脐带间充质干细胞的滤液，依次传代培养，可...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄庆雷，邓钺，沈丽，
申请(专利权)人：北京弘润天源基因生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11