一种小鼠肝脏原代细胞培养基、培养方法及培养箱技术

本发明专利技术提供了一种小鼠肝脏原代细胞培养基及培养方法，培养基配方为：William’s E培养基，牛血清白蛋白，胰岛素，和地塞米松，L‑谷氨酰胺，青霉素，链霉素。培养方法为：使用所述小鼠肝脏原代细胞培养基进行小鼠肝脏原代细胞的培养。本发明专利技术的培养基完全可以满足原代肝脏细胞的生长需求，细胞生长状态良好，且培养基配制简单，成本低，具有快速、经济、高效的优点。本发明专利技术的培养方法在所有阶段均未使用胎牛血清，避免了血清的复杂成分对小鼠原代肝脏细胞造成的影响。本发明专利技术还提供了一种改进的细胞培养箱。

【技术实现步骤摘要】
一种小鼠肝脏原代细胞培养基、培养方法及培养箱
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种小鼠肝脏原代细胞培养基、培养方法及培养方法中使用到的培养箱。
技术介绍
来源于肝脏经特殊分离方法制备而来的原初培养的肝脏细胞称之为原代肝细胞。将小鼠的肝脏从机体中取出，经胰酶、螯合剂(常用EDTA)处理，分散成单细胞，用肝脏组织制备的细胞以肝细胞为主，但是还有胆管上皮细胞，星形细胞，肝血窦内皮细胞，血细胞等需要清除，通过一定大小的网筛筛选，合适的转速离心，同时置于合适的培养基中培养筛选，最终才能获得高纯度的肝细胞。高纯度的肝脏原代细胞在研究肝脏的生物学实验中使用非常广泛，是肝脏分子生物学研究中的重要工具细胞，因此研发一个性价比高，使用效果好的原代肝脏细胞培养基具有重要的意义。现有的肝脏原代细胞的培养基主要是购买国外品牌赛默飞世尔科技旗下的HepatoZYME-SFM无血清培养基，此外添加胎牛血清等维持原代肝脏细胞的生长和性能。例如《热带医学杂志》2008年第10期论文“改良原代大鼠肝细胞的体外分离培养和功能研究”使用含有胎牛血清的HepatoZYME-SFM培养原代大鼠肝细胞；《世界华人消化杂志》2011年第19期论文“成人原代肝细胞的分离、培养及冻存”使用含胎牛血清和DMSO的HepatoZYME-SFM培养成人原代肝细胞。现存在的问题：HepatoZYME-SFM无血清培养基货品价格昂贵且用量很大，在肝脏原代细胞的培养中造成了很多的不便。而且胎牛血清成分复杂，对原代细胞的生长具有许多不确定的影响因素，尤其是胎牛血清中高含量的内毒素、多胺氧化酶和血清中所含的抗体、补体以及可能含有的支原体、病毒等对原代肝脏细胞的生长具有毒害作用。此外胎牛血清中含有的成份、含量及其作用机制仍不清楚，尤其是其中的一些多肽类生长因子、激素和脂类的对细胞的影响尚未充分认识，此外其中含有的众多激素可诱导小鼠原代肝脏细胞的异形性分化，导致小鼠原代肝脏细胞的性状改变，从而使获得高标准的肝脏原代细胞受到限制。《癌变·畸变·突变》2016年第28期论文“原代小鼠肝细胞培养方法的比较”比较了3种不同培养条件下原代小鼠肝细胞的形态以及肝细胞功能，寻找适合于原代小鼠肝细胞体外培养的培养基配方。具体的小鼠原代肝细胞培养方法为：小鼠原代肝细胞以1.0×105/cm2的细胞密度接种于包被有鼠尾胶原的培养板内，使用贴壁培养基(William’sE培养基、体积分数为10％的胎牛血清、1μmol/L地塞米松、4μg/mL牛胰岛素、2mmol/LL-谷氨酰胺，100U/ml青霉素、100μg/mL链霉素，15mmol/LHEPES)在37摄氏度，体积分数为5％的CO2培养箱内培养4小时后，将培养基吸出，铺上层胶原，形成三明治结构，2小时后分为3组分别加入不同的无血清培养基来维持肝细胞生长。3组的培养基分别为基础培养基、基础培养基加DMSO(DMSO组)、基础培养基加DMSO和EGF(DMSO+EGF组)，其中基础培养基为：William’sE培养基、0.1μmol/L地塞米松、4μg/mL牛胰岛素、2mmol/LL-谷氨酰胺，100U/ml青霉素、100μg/mL链霉素，15mmol/LHEPES，结果表明小鼠原代肝细胞培养基中加入DMSO对于维持肝细胞的形态和功能有促进作用。专利CN102643778A，2012.08.22，公开了一种畜禽原代肝细胞分离、培养与鉴定的方法，将螯合法与原位两步灌流法进行整合，预先脱去畜禽肝脏组织内Ca2+与Mg2+，使之尽量多地释放出原代肝细胞，通过调整培养液的添加物配方，完善其无血清培养体系，并就所获原代肝细胞进行糖原鉴定。其中畜禽原代肝细胞的具体培养方法为：细胞计数后，用贴壁培养液将细胞悬液稀释为2～5×105/ml，在直径为60ml的培养瓶中接种15ml，接种密度为1×105/cm2，在37摄氏度、5％CO2和饱和湿度的条件下培养，4小时细胞贴壁后，用生长培养液全量换液，该生长培养液中含体积百分比为10％的新生牛血清及双抗的基础培养液继续培养20小时。此后，用无血清培养液、10μg/ml维生素C、0.15％BSA和双抗的Williams’mediumE基础培养液)全量换液，该无血清培养液中含5×10-7M地塞米松、1×SITE(这是(insulin,transferrin,selenium,ethanolamine)的缩写，Sigma-Aldrich-Aldrich公司，含10μg/ml牛胰岛素、5.5μg/ml人转铁蛋白、2.9×10-8M亚硒酸钠、2μg/ml乙醇胺)，以后每24小时更换培养液，倒置显微镜下观察肝细胞形态及生长情况。但目前还未见不使用胎牛血清对小鼠肝脏原代细胞进行培养，且能够保证细胞生长状态良好的培养基和培养方法。同时，在进行细胞培养时，培养箱的方便使用也有利于细胞培养的顺利进行，当前现有的生物细胞培养箱只能放置固定高度的培养皿或培养瓶，适用范围有限，比如专利CN203462058U，2014.03.05，公开了一种生物细胞培养装置，该生物细胞培养装置可以利用立柱上的可拆卸的卡合箍，使用者可以随意调节卡合箍之间的间距，可以放置任何制尺寸的培养瓶或培养皿，但在实际使用过程中，由于该装置不便于实验操作人员对培养基或培养皿放置和取出，容易发生碰撞，导致培养皿受损或受污染等情况，需要对该装置进行改进，因此本专利技术也提出一种改进的细胞培养箱用于解决上述问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种小鼠肝脏原代细胞培养基及培养方法。所述小鼠肝脏原代细胞培养基，配方为：William’sE培养基，0.9％-1.1％牛血清白蛋白，0.9-1.1nmol/L胰岛素，和98-102nmol/L地塞米松，1.9-2.1mmol/LL-谷氨酰胺，95-105U/ml青霉素，95-105ug/ml链霉素。优选配方为：William’sE培养基，1％牛血清白蛋白，1nmol/L胰岛素，和100nmol/L地塞米松，2mmol/LL-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素。所述小鼠肝脏原代细胞培养方法，使用如上任一所述的小鼠肝脏原代细胞培养基进行培养。优选包括以下步骤：1)将经原位灌注后获取的肝脏放于预冷的灌注液II中；2)分离肝脏原代细胞，重悬于如上任一所述的小鼠肝脏原代细胞培养基中；3)将肝脏原代细胞悬液接种于胶原处理过的培养装置，在37摄氏度，体积分数为5％的CO2培养箱内培养，每隔5-7小时使用如上任一所述的小鼠肝脏原代细胞培养基常规换液。优选所述灌注液II配方为：不含钙离子的Kreb-Ringer’s磷酸盐缓冲液，0.1％葡萄糖，0.5mg/mlI型胶原酶，0.1％葡萄糖，5mmol/L氯化钙，100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素。优选初始培养密度为1.2*106/ml。优选每隔6小时常规换液。优选所述胶原处理过的培养装置其处理方法为：胶原蛋白用0.02mol/l醋酸稀释到50ug/ml后，在细胞操作橱中，向培养装置中加入胶原溶液；在室温下放置1-2小时后，将胶原溶液吸出，用PBS洗三遍；在细胞操作橱中通风过夜吹干。本专利技术的培养基及培养方法，其有益效果在于：1、本专利技术的培养基成分均明本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小鼠肝脏原代细胞培养基，其特征在于，配方为：William’s E培养基，0.9％‑1.1％牛血清白蛋白，0.9‑1.1nmol/L胰岛素，和98‑102nmol/L地塞米松，1.9‑2.1mmol/L L‑谷氨酰胺，95‑105U/ml青霉素，95‑105ug/ml链霉素。

【技术特征摘要】
1.一种小鼠肝脏原代细胞培养基，其特征在于，配方为：William’sE培养基，0.9％-1.1％牛血清白蛋白，0.9-1.1nmol/L胰岛素，和98-102nmol/L地塞米松，1.9-2.1mmol/LL-谷氨酰胺，95-105U/ml青霉素，95-105ug/ml链霉素。2.根据权利要求1所述的小鼠肝脏原代细胞培养基，其特征在于，配方为：William’sE培养基，1％牛血清白蛋白，1nmol/L胰岛素，和100nmol/L地塞米松，2mmol/LL-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素。3.一种小鼠肝脏原代细胞培养方法，其特征在于，使用如权利要求1或2任一所述的小鼠肝脏原代细胞培养基进行培养。4.根据权利要求3所述的小鼠肝脏原代细胞培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将经原位灌注后获取的肝脏放于预冷的灌注液II中；2)分离肝脏原代细胞，重悬于如权利要求1或2任一所述的小鼠肝脏原代细胞培养基中；3)将肝脏原代细胞悬液接种于胶原处理过的培养装置，在37摄氏度，体积分数为5％的CO2培养箱内培养，每隔5-7小时使用权利要求1或2任一所述的小鼠肝脏原代细胞培养基常规换液。5.根据权利要求4所述的小鼠肝脏原代细胞培养方法，其特征在于，所述灌注液II配方为：不含钙离子的Kreb-Ringer’s磷酸盐缓冲液，0.1％葡萄糖，0.5mg/mlI型胶原酶，0.1％葡萄糖，5mmol/L氯化钙，100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素。6...

【专利技术属性】
技术研发人员：江泉，李欣伦，祝加和，金治全，许冉，潘珍珍，孟婉冰，李超，李秋圆，
申请(专利权)人：上海银海圣生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31