一种提高脐带间充质干细胞回收率的消化方法技术

本发明专利技术公开了一种提高脐带间充质干细胞回收率的消化方法，其特征在于：包括以下步骤：向含有消化剂的脐带间充质干细胞混合液内加入含有ALB的生理盐水终止胰酶消化作用。本发明专利技术的有益效果是：（1）本发明专利技术提高了消化后脐带间充质干细胞的回收率。（2）本发明专利技术降低了脐带间充质干细胞的培养成本，有利于脐带间充质干细胞大量培养，以满足更大需求的科学研究等。

【技术实现步骤摘要】
一种提高脐带间充质干细胞回收率的消化方法
本专利技术涉及脐带间充质干细胞领域，尤其涉及一种提高脐带间充质干细胞回收率的消化方法。
技术介绍
脐带间充质干细胞(UmbilicalCordMesenchymalStemCells，UCMSCs)一般指来自于新生儿脐带华氏通胶的一种多功能干细胞，UCMSCs可以自我更新、复制和多个方向进行分化，在软骨、肌肉、韧带、神经、肝脏、内皮和心肌等疾病方面具有广阔的临床应用前景。UCMSCs在分离和培养过程中，一般会经过脐带剪切、双酶消化、贴壁培养、胰酶消化和终止、收集和传代等操作过程，而间充质干细胞在原代培养获得后进行的主要工作就是传代和培养。因间充质干细胞属贴壁生长细胞，在进行传代和培养工作过程中，需要使用胰酶将贴壁的干细胞从培养瓶壁消化脱落，因细胞表面有许多蛋白分子，为避免过度消化对细胞造成形态结构或功能的改变，需要在培养瓶内加入胰酶消化一段时间后添加终止液以终止酶消化作用。在实际实验操作过程中，通常所用的终止液是添加了胰酶抑制剂的完全培养基，这一方法操作简便，终止效果良好，为绝大多数高校、科研院所及医院等实验室采用。但是，进口完全培养基价格高昂，实验条件下少量使用尚可接受，对于大量培养干细胞用于临床研究等方面时，培养基成本成为不可避免的问题。此外，我们在实践中发现，使用添加胰酶抑制剂的完全培养基终止酶消化作用时，因一次性消化数量较多，消化后的干细胞在操作过程中会出现重新贴壁的现象，这使得回收的干细胞有一定数量的减少，造成浪费。
技术实现思路
为了解决上述
技术介绍
中提出的问题，本专利技术提供了一种提高脐带间充质干细胞回收率的消化方法，包括以下步骤：向含有消化剂的脐带间充质干细胞混合液内加入含有ALB的生理盐水终止胰酶消化作用。优选的，所述消化剂为质量体积分数为0.25%的胰酶PBS溶液。优选的，所述含有ALB的生理盐水为质量体积比5mg/ml-8mg/ml的ALB生理盐水。优选的，所使用的PBS溶液的pH值为7.2-7.4。优选的，所使用的生理盐水的质量分数为0.9%。本专利技术的有益效果是：1)本专利技术提高了消化后脐带间充质干细胞的回收率。2)本专利技术降低了脐带间充质干细胞的培养成本，有利于脐带间充质干细胞大量培养，以满足更大需求的科学研究等。附图说明图1为本专利技术A组间充质干细胞抽样流式检测结果图。图2为本专利技术B组间充质干细胞抽样流式检测结果图。图3为图1和图2中每个图表的放大样例图。具体实施方式下面对本专利技术的实施例进行详细阐述，以使本专利技术的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本专利技术的保护范围做出更为清楚明确的界定。英文缩写解释说明：ALB：白蛋白；PBS：磷酸缓冲盐溶液。实施例1、主要仪器、试剂、耗材仪器：ThermoCO2培养箱，Thermo离心机，SD-WJ-2HD超净工作台，AccuriC6plus流式细胞仪，JSY-SC-021H细胞计数仪。试剂：GENVIEWPBS，Gibco胰酶，Gibco青霉素/链霉素，Helios血清，GibcoMEMα培养基，CD抗体，肝素钠，质量分数为20%的ALB溶液，质量分数为0.9%生理盐水，pH7.2PBS。耗材：T175细胞培养瓶，10ml-50ml移液管，50ml离心管，细胞计数板。2、方法步骤（1）将实验室冻存的P2代脐带间充质干细胞复苏，于T175细胞培养瓶内37℃、5%CO2培养至融合约80%-90%时传代扩培至P4代；（2）待P4代细胞生长融合至约80%-90%时，用pH7.2PBS洗涤后，用质量体积分数为0.25%的胰酶PBS溶液消化并收集计数，按照10^4个/cm2密度接种至若干个T175培养瓶，每瓶接种细胞总量为(1.75±0.13)×10^6个，随机将培养瓶分为A、B两组，每组6个培养瓶；（3）同时将A、B组培养瓶置于37℃、5%CO2相同条件下培养；（4）待A、B两组细胞生长融合约80%-90%时，用pH7.2PBS重复洗涤3次，彻底洗去未贴壁细胞、杂质以及培养基；（5）向A、B组各培养瓶加4ml的质量体积分数为0.25%的胰酶PBS溶液，将培养瓶平置在工作台消化1min，轻轻侧面拍打培养瓶，使细胞从瓶壁脱落；（6）分别向A组培养瓶内加入6ml含有胰酶抑制剂的MEMα完全培养基，向B组培养瓶内加入10ml含ALB5mg/ml的生理盐水终止胰酶消化作用；（7）将A、B组各瓶内的细胞分别收集至50ml离心管内，1600rpm离心5min，去上清；（8）沉淀用15mlpH7.2PBS重悬，混匀，1600rpm离心5min，去上清，重复1次；（9）用50mlpH7.2PBS重悬沉淀，混匀，分别从A、B组各管细胞取样本100ul做细胞计数和流式检测。3、结果细胞计数结果显示，A组各培养瓶细胞数量平均为（6.69±0.20）×10^7个，B组各培养瓶细胞数量平均为（7.12±0.12）×10^7个，两组培养细胞数量差异性显著（P＜0.05）（表1）；在细胞活率方面，A组各培养瓶细胞活率平均为（91%±3%），B组各培养瓶细胞数量平均为（91%±2%），两组细胞活率无明显差异（P＞0.05）（表2）。表1：细胞计数结果统计表2：细胞活率结果统计抽样流式检测结果显示，A、B两组各瓶细胞表面标志物CD29+、CD90+、CD105+、CD34-、CD45-比例都在95%以上（图1，图2），说明A、B两组细胞都高表达间充质干细胞表面标志物CD29+、CD90+、CD105+，不表达或少表达造血干细胞表面标志物CD34-、CD45-，证明A、B两组细胞是间充质干细胞。从实验结果可以看出，在应用生产过程中涉及大量制备干细胞时，利用本专利技术较传统方法可以获得更多量的干细胞，避免消化后重新贴壁造成的细胞损失，而且经本专利技术收获的干细胞，其细胞活率和细胞表型不受影响，细胞状态良好。对所公开的实施例的上述说明，仅为了使本领域专业技术人员能够实现或使用本专利技术。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本专利技术的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本专利技术将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高脐带间充质干细胞回收率的消化方法，其特征在于：包括以下步骤：向含有消化剂的脐带间充质干细胞混合液内加入含有ALB的生理盐水终止胰酶消化作用。

【技术特征摘要】
1.一种提高脐带间充质干细胞回收率的消化方法，其特征在于：包括以下步骤：向含有消化剂的脐带间充质干细胞混合液内加入含有ALB的生理盐水终止胰酶消化作用。2.根据权利要求1所述的一种提高脐带间充质干细胞回收率的消化方法，其特征在于：所述消化剂为质量体积分数为0.25%的胰酶PBS溶液。3.根据权利要求1所述的一种提高脐带间充质干细胞回收率的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李冲杰，孙洪霞，李宾宾，秦雯娜，
申请(专利权)人：李冲杰，
类型：发明
国别省市：山东,37