用消化酶组合物从胎盘血管分离间充质干细胞制造技术

本发明专利技术涉及用消化酶组合物从胎盘血管分离间充质干细胞。具体涉及从胎盘血管分离胎盘间充质干细胞的方法中使用的消化酶组合物，含有组织消化酶的缓冲液是在缓冲液中添加消化酶：胰酶、脱氧核糖核酸酶I、胶原酶II、胶原酶IV、透明质酸酶。此外，本发明专利技术还涉及从胎盘血管中分离间充质干细胞的方法，包括步骤：胎盘消毒；从胎盘剥离出胎盘血管；剪碎，清洗，滤除血污，得到胎盘血管组织；加混合酶液消化；终止消化，过滤收集组织液；离心所得细胞沉淀为原始胎盘间充质干细胞，重悬，取样计数有核细胞数和活率；所得细胞冻存，或者继续传代和/或进行细胞鉴定、检测、冻存、建库等。本发明专利技术方法可以有效提高从胎盘血管分离间充质干细胞的效率。

【技术实现步骤摘要】
用消化酶组合物从胎盘血管分离间充质干细胞
本专利技术涉及从胎盘的血管中分离干细胞的方法，特别涉及从胎盘的血管中分离间充质干细胞的方法，更特别的是涉及一种使用本专利技术所述独特配方的消化酶组合物从而从胎盘的血管分离间充质干细胞的方法。使用本专利技术方法可以有效的提高从胎盘的血管分离间充质干细胞的效率。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymalstemcell，MSC)例如人类的间充质干细胞最早是从骨髓中分离出来的，来源于中胚层的一类具有多向分化潜能和自我更新能力的组织干细胞，在体内和体外特定条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌细胞、肝细胞等多种成体细胞分化的能力(CaplanAI.Mesenchymalstemcells.JOrthopRes.1991,9:641-650.PittengerMF,MackayAM,BeckSC,etal.Multilineagepotentialofadulthumanmesenchymalstemcells.Science.1999；284:143-147)。最新的研究表明间充质干细胞具有免疫调节和造血支持作用，而且易于外源基因导入表达。因此间充质干细胞不但是组织工程化骨、软骨和心肌构建中的种子细胞，基因治疗中重要的载体细胞，而且由于间充质干细胞促进造血重建和抑制移植物抗宿主反应功能，在造血干细胞移植和器官移植中具有广泛的应用前景。间充质干细胞具有体外贴壁生长的特性，利用这种特性，人们已经成功从肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、软骨、皮肤、外周血等多种组织中分离培养出间充质干细胞。目前所报道的间充质干细胞主要来源于骨髓，采用密度梯度离心法获得。虽然分离方法简便，但供者取髓需要经历一个比较痛苦的手术，并在取材过程中及取材后会有很高的感染机会；由于人体骨髓中MSC的含量极其稀少，每105～106个单个核细胞中大约只有1个，而且随着年龄的增加，骨髓中间充质干细胞的数量、增殖和分化能力均显著下降，使其在研究和应用尤其是临床应用中受到限制。起源于胚胎发育期胚外中胚层的胎盘是由间质、血管及滋养细胞组成，含有大量的间充质成分。最新的研究表明胎盘中含有丰富的干细胞，从胎盘中分离培养出这些多能干细胞将为实验研究和临床应用开辟一个崭新而丰富的来源。现有的从胎盘中分离干细胞从而建立胎盘干细胞库的方法尚有诸多缺点，例如纯度不足、和/或数量不高，进而显示出这些方法尚不能满足人们的期待。例如CN101270349A(中国专利申请号200810061267.6，公开日2008年9月24日)公开的题为“胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养方法”的专利技术；CN101693884A(中国专利申请号200910117522.9，公开日2010年4月14日)公开的题为“一种从胎盘、脐带或脂肪组织中分离提取干细胞的方法”的专利技术；CN102146359A(中国专利申请号201110005964.1，公开日2011年8月10日)公开的题为“从胎盘中提取原始间充质干细胞及无血清扩增的方法”的专利技术。另外，中国专利申请号201210044648X公开了一种从胎盘中分离间充质干细胞的方法。这些方法在提取物的纯度和/或回收率方面是有待进一步改善的。间充质干细胞作为成体干细胞的一种，来源于发育早期中胚层，因具有高度自我更新、免疫调控和多向分化潜能而备受关注。间充质干细胞广泛存在于全身各种组织中，特别是骨髓、脂肪组织、脐血。临床研究中的间充质干细胞主要来自骨髓。目前传统的方法是在全麻或椎管内麻醉下从骨髓中取得干细胞，但每毫升的骨髓中仅能获取100～1000集落生成单位的骨髓间充质干细胞，且必须经过体外扩增才能获得临床需要的细胞数目，此方法不仅价格昂贵，增加患者痛苦，而且需消耗较长的治疗时间，限制了骨髓间充质干细胞的临床应用前景。2003年，Mitchell等首先证实了从脐带提取的间充质干细胞具有多向分化潜能，随后又有多名学者从脐带华通胶中分离到成纤维样细胞，并证实其具有自我更新增殖及多向分化潜能，命名为人脐带间充质干细(hUC-MSCs)。人脐带间充质干细是指存在于脐带中的间充质干细胞，脐带作为分娩废弃物，相比其它间充质干细胞，人脐带间充质干细具有亚全能分化潜能，其获取简单、来源丰富、培植过程也比其它干细胞快约一倍，生长均匀，具有很多作为种子细胞的优良特性，如增殖活性高、免疫原性低、无致瘤性等，来源充足，无伦理问题等的优势。人脐带间充质干细在再生医学和组织工程学中的潜力，已经引起了人们很大兴趣，与来自骨髓的MSCs相比，人脐带间充质干细具有优越性，人脐带表面为羊膜被覆上皮，其中包含两个动脉和一个静脉，脐带血管周围环绕着粘液样结缔组织(称为华通氏胶，WJ)。脐带间充质干细胞的来源包括羊膜、羊膜下层、华通氏胶、脐带血管、脐带血管周围组织和脐血。目前临床上广泛应用的是华通氏胶来源的间充质干细胞。目前人脐带间充质干细胞的研究方面尚有缺陷。主要包括：(1)脐带采集后脐静、动脉血液凝固，加大脐带处理的难度，同时血细胞过多增加干细胞污染的机会；(2)组织贴壁法是将脐带切割为细小组织块直接贴附于培养基上，一般15天左右可获得原代细胞；这种方法的缺点在于，周期长；组织块易漂起，使其丧失了长出细胞的能力，减少了细胞数量，此外细胞纯度不足；(3)酶消化法多采用胶原酶与胰蛋白酶并用，虽然周期短，但是费用高，条件不易掌握，常温消化时间长则可能损伤细胞，消化时间短则液体粘稠，难以通过离心获得足够量细胞，而且增加了临床应用过程中动物源性蛋白引起过敏反应和交叉感染的安全风险。近年脐带血管周干细胞因其高增殖活性、高克隆形成力和多向分化潜能，被认为是间充质干细胞的祖细胞，具有广泛的临床应用前景。2013年，TsangWP等研究指出，CD146+的血管周细胞可作为骨再生的细胞来源。CN105695401A(CN201610189133.7)公开了一种脐带动脉和静脉血管周干细胞的制备和保存方法，通过细胞培养液(DMEM低糖、10％胎牛血清、1％青链霉素双抗)进行培养，比普通的贴片法获得更高纯度的脐带血管周来源的间充质干细胞；不采用消化酶，避免了动物源性蛋白引起的过敏反应和交叉感染，而且非酶原消化法分离得到的脐带血管周干细胞比华通氏胶来源的间充质干细胞CD146阳性率更高。人们期望有新的人间充质干细胞的来源，例如从胎盘的血管中分离得到间充质干细胞，然而现有技术尚未见从胎盘的血管中分离间充质干细胞的方法。因此本领域仍然期待能够成功的从胎盘的血管中分离间充质干细胞。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决现有获取胎盘间充质干细胞资源的不足，提供一种实用、简单、高效的从胎盘的血管中分离间充质干细胞并任选地建立干细胞库的方法。同时，本专利技术的另一目的在于为上述从胎盘血管中分离间充质干细胞的方法提供一种消化酶组合物。本专利技术人发现采用特别的操作方法以及特别组方的消化酶组合物，所获得的细胞纯度高和/或细胞回收率高。本专利技术基于此发现而得以完成。为此，本专利技术第一方面提供了一种在从胎盘血管分离胎盘间充质干细胞的方法中使用的消化酶组合物，该消化酶组合物是含有组织消化酶的PBS缓冲液，该含有组织消化酶的PBS缓冲液是在PBS缓冲液中添加选自下列的一种或多种消化酶：dispase、胰本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.从胎盘血管分离胎盘间充质干细胞的方法中使用的消化酶组合物，该消化酶组合物是含有组织消化酶的PBS缓冲液，该含有组织消化酶的PBS缓冲液是在PBS缓冲液中添加选自下列的一种或多种消化酶：dispase、胰酶、脱氧核糖核酸酶I(DNase I)、胶原酶II、胶原酶IV、透明质酸酶；例如，该消化酶组合物中包含下列的消化酶：脱氧核糖核酸酶I(DNase I)、胶原酶II、胶原酶IV。

【技术特征摘要】
1.从胎盘血管分离胎盘间充质干细胞的方法中使用的消化酶组合物，该消化酶组合物是含有组织消化酶的PBS缓冲液，该含有组织消化酶的PBS缓冲液是在PBS缓冲液中添加选自下列的一种或多种消化酶：dispase、胰酶、脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)、胶原酶II、胶原酶IV、透明质酸酶；例如，该消化酶组合物中包含下列的消化酶：脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)、胶原酶II、胶原酶IV。2.根据权利要求1的消化酶组合物，含有所述消化酶的PBS缓冲液中包含：0.1～0.3％例如0.2％胶原酶II、0.1～0.2％例如0.15％胶原酶IV、0.05～0.15％例如0.1％脱氧核糖核酸酶I；例如，含有所述消化酶的PBS缓冲液中包含：0.2％胶原酶II、0.15％胶原酶IV、0.1％脱氧核糖核酸酶I；例如，所述混合酶液中还添加0.02～0.05％谷氨酸钠和0.01～0.05％海藻酸铵；例如，所述混合酶液中包含：0.1～0.3％例如0.2％胶原酶II、0.1～0.2％例如0.15％胶原酶IV、0.05～0.15％例如0.1％脱氧核糖核酸酶I、0.02～0.05％例如0.03％谷氨酸钠和0.01～0.05％例如0.025％海藻酸铵。3.从胎盘的血管中分离间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤：(1)将胎盘浸泡于75％酒精消毒30秒，然后用PBS冲洗两遍；(2)从胎盘的脐带根处剥离出胎盘血管，用手术镊挤压血管以清除血污；(3)将血管剪碎成1～2mm^3碎块，用PBS清洗，再用300目滤网过滤去除残留血污，得到胎盘血管组织；(4)加混合酶液消化；(5)添加血清终止消化，再用300目滤网过滤，收集组织液，PBS洗涤，合并清洗液；(6)离心得到细胞沉淀，用PBS清洗一遍，离心，得到原始的胎盘间充质干细胞(P0代)，用DMEM-F12基础培养基重悬，取样并计数有核细胞的数量和活率；所得细胞用冻存保护液冻存以便使用前再复苏培养，或者所得细胞接着进行下面步骤的操作；(7)使细胞接种至T75培养瓶，添加完全培养基培养；(8)培养过程中每3天换液一次，直至细胞融合率达80％以上，传代，得到P1代胎盘间充质干细胞；以及任选的下列一个或多个步骤：(9)针对步骤(8)所得胎盘间充质干细胞进行细胞鉴定和/或检测(例如，包括但不限于，成脂、成骨和成软骨性、流式检测、HLA鉴定、细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型)；(10)将步骤(8)所得传代后的胎盘间充质干细胞于液氮中冻存；(11)建立包含以上信息的胎盘干细胞的数据库，并使该数据库与步骤(10)的冻存细胞进行关联。4.根据权利要求3的方法，其中步骤(4)中所述混合酶液是添加了...

【专利技术属性】
技术研发人员：王正，肖海蓉，
申请(专利权)人：博雅干细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32