一种胎盘间充质干细胞的分离方法技术

本发明专利技术提供了一种胎盘间充质干细胞的分离方法，属于生物技术领域。本发明专利技术先取离心管，在垂直于离心管轴线的平面上放置一片滤板，使滤板下方的离心管容积占离心管总容积的20～40％，滤板中心位置设置圆孔；滤板还设置若干个相互平行的条形筛条，每两个相邻筛条之间形成长方形筛孔；然后通过圆孔向离心管中加入细胞分离液至液面没过滤板；再将新鲜的胎盘组织消化液加入到离心管中，1000～2000rpm离心10～30min；最后倒掉滤板上层消化液，用吸管穿过圆孔，吸取得到含有胎盘间充质干细胞的细胞分离液。本发明专利技术提供的方法不用中和胰酶，不须用100um细胞筛网过滤，操作简单、快速，能提高干细胞产量和活力。

【技术实现步骤摘要】
一种胎盘间充质干细胞的分离方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种胎盘间充质干细胞的分离方法。
技术介绍
干细胞是人体内一类能够自我更新分化的细胞，其来源广泛，分化潜能多样，具有多种生理效应。随着人们对干细胞的鉴定和认识，其逐渐受到临床应用的青睐，在治疗疾病、提高病人生存质量上已取得显著成效。干细胞的应用是一个转化医学的问题，其应用主要涉及细胞治疗、细胞美容、细胞诊断以及干细胞相关副产品的开发。间充质干细胞是干细胞中来源最广的一类细胞，其来源主要有胎盘、脐带、骨髓和脂肪。胎盘和脐带是生育后的无用组织，在组织采集过程对人体没有创伤，其组织内的间充质干细胞没有随成人生长接触过多的不利因素，获取到的间充质干细胞更加安全，因此胎盘和脐带是间充干细胞的理想来源。近几年来，间充质干细胞的安全性和有效性在临床中得到了证实。国际上已有间充质干细胞药物成功上市，实现了传统化学药物向现代化细胞药物的转变。如何安全有效的分离间充干细胞，是干细胞产品质量和产业化的保障。在现有的技术体系中，胎盘间充质干细胞的分离方法主要两大类：胰酶消化法和灌注法。酶消化法，是将胎盘组织剪成碎块后，用胰蛋白酶或胶原酶消化1-2小时，用含胎牛血清的培养基终止酶消化，然后洗涤细胞弃去消化酶，将洗涤后的细胞接种至培养器皿中进行培养扩增。该方法在组织剪切和消化过程中会破坏大量细胞，释放大量染色体，导致消化液非常粘稠。在细胞培养环境中如果含有大量DNA，将干扰细胞的贴壁和生长。因此，一般需要使用100um孔径的细胞筛网过滤消化液，细胞过滤需要1～2小时。细胞筛网过滤消化液的操作时间过长，容易导致获得的细胞活力低、增殖慢。另外，因为消化液非常粘稠，其在过滤的过程中也极易阻塞细胞筛网。灌流法是利用胎盘特殊的解剖结构，用灌流液孵育胎盘，从灌流液中分离单个核细胞，洗涤后再用间充质干细胞培养基悬浮所获细胞，进行培养。该方法从胎盘组织中提取间充质干细胞，由于胎盘中血液含量多，冲洗时消耗的试剂量极大，且血液难以彻底冲洗。
技术实现思路
有鉴于
技术介绍
中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种胎盘间充质干细胞的分离方法，获得的胎盘干细胞活性高，红细胞含量少，为胎盘干细胞的临床应用以及产业化提供保障。本专利技术提供了一种胎盘间充质干细胞的分离方法，包括如下步骤：(1)取离心管，在垂直于离心管轴线的平面上放置一片滤板，使滤板下方的离心管容积占离心管总容积的20～40％，所述滤板的中心位置设置一个用于加液的圆孔，所述圆孔的直径为0.45～0.75cm；所述滤板还设置若干个相互平行的条形筛条，每两个相邻筛条之间形成长方形筛孔，所述筛孔的宽为0.15～0.25cm；(2)通过步骤(1)所述圆孔向离心管中加入细胞分离液，所述细胞分离液的添加量以没过滤板为标准；(3)将新鲜的胎盘组织消化液加入到离心管中，1000～2000rpm离心10～30min，实现组织消化液的分层；(4)倒掉滤板上层消化液，穿过圆孔吸取滤板下的含有胎盘间充质干细胞的细胞分离液。优选的，所述步骤(2)中细胞分离液为添加有5～15％体积含量胎牛血清和20～60g/L葡聚糖的DMEM培养基。优选的，所述步骤(3)中胎盘组织消化液的制备方法包括如下步骤：①将胎盘组织置于质量体积比为0.1～0.3％g/ml的胰蛋白酶溶液中，预消化10～20min，得到预消化后的胎盘组织；②将所述预消化后的胎盘组织剪碎，得到单个体积为1～2mm3的肉糜；③将所述肉糜与胎盘消化液按照1:4～8的体积比混合，36～38℃消化20～40min，得到胎盘组织消化液。优选的，所述步骤①胎盘组织为经病毒检测合格的绒毛膜组织或者底蜕膜组织。优选的，所述步骤①胎盘组织在预消化前，还包括清洗，所述清洗用试剂为含有80～250kU/L青霉素和80～250kU/L链霉素的PBS缓冲液。优选的，所述步骤③中胎盘消化液为添加有质量体积比为0.1～0.3％g/ml的胰蛋白酶和质量体积比为0.2～0.4％g/ml胶原蛋白酶的PBS缓冲液。优选的，所述步骤(4)得到含有胎盘间充质干细胞的细胞分离液后，培养所述胎盘间充质干细胞。优选的，所述培养前包括离心分离的步骤，所述离心分离的离心力为500～700g，时间为5～15min。优选的，所述培养开始后36～60h全量换液，继续培养，所述继续培养每2～4天进行半量换液。优选的，当细胞融合度达到90％时，进行细胞的成软骨、成骨和成脂肪诱导。有益效果：本专利技术提供了一种胎盘间充质干细胞的分离方法，先取离心管，在离心管容积20～40％处放置滤板，滤板中心位置设置圆孔，圆孔的直径为0.45～0.75cm；滤板上设置若干个相互平行的条形筛条，每两个相邻筛条之间形成长方形筛孔，筛孔的宽为0.15～0.25cm；然后通过圆孔向离心管中加入细胞分离液至液面没过滤板；再将新鲜的胎盘组织消化液加入到离心管中，1000～2000rpm离心10～30min；最后倒掉滤板上层消化液，用吸管穿过圆孔，吸取得到含有胎盘间充质干细胞的细胞分离液。本专利技术提供的方法改进了传统的酶消化法分离细胞技术，使用滤板和细胞分离液，从而不需要传统酶消化法中和胰酶步骤，避免使用细胞筛过滤消化液。细胞分离液的密度梯度可以仅通过一次离心将胎盘间充质干细胞和红细胞以及DNA初步分离，并通过细胞分离液初步将干细胞和红细胞分离，从而不须用100um细胞筛网过滤，简化了操作步骤，缩短操作时间，提高效率的同时提高了细胞的得率和活性。附图说明图1为本专利技术所述离心管的结构示意图；其中图1-A表示滤板，a表示圆孔直径，b表示滤板直径；图1-B表示加入细胞分离液和胎盘组织消化液后的离心管经离心操作后的分层状态；其中①表示染色体团，②表示滤板，③表示单核细胞层，④表示红细胞层；图2为本专利技术实施例1所述成骨、成软骨、成脂肪诱导后的结果图；图3为本专利技术实施例1所述流式分析细胞表面Mark的结果图；图4为本专利技术实施例2所述流式分析细胞表面Mark的结果图；图5为本专利技术实施例3所述细胞活力测定的对比结果；图6为本专利技术实施例3所述细胞分离时间统计的对比结果。具体实施方式本专利技术提供了一种胎盘间充质干细胞的分离方法，包括如下步骤：(1)取离心管，在垂直于离心管轴线的平面上放置一片滤板，使滤板下方的离心管容积占离心管总容积的20～40％，所述滤板的中心位置设置一个用于加液的圆孔，所述圆孔的直径为0.45～0.75cm；所述滤板还设置若干个相互平行的条形筛条，每两个相邻筛条之间形成长方形筛孔，所述筛孔的宽为0.15～0.25cm；(2)通过步骤(1)所述圆孔向离心管中加入细胞分离液，所述细胞分离液的添加量以没过滤板为标准；(3)将新鲜的胎盘组织消化液加入到离心管中，1000～2000rpm离心10～30min，实现组织消化液的分层；(4)倒掉滤板上层消化液，穿过圆孔吸取滤板下的含有胎盘间充质干细胞的细胞分离液。本专利技术取离心管作为反应容器，所述离心管的规格优选为20～100ml，更优选为50ml。本专利技术在垂直于离心管轴线的平面上放置一片滤板，所述滤板的直径优选为2.5～3cm，更优选为2.75cm。所述滤板下方的离心管容积占离心管总容积的20～40％，优选占离心管总容积的30％。本专利技术在所述滤板的中心位置设置一个圆孔本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胎盘间充质干细胞的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取离心管，在垂直于离心管轴线的平面上放置一片滤板，使滤板下方的离心管容积占离心管总容积的20～40％，所述滤板的中心位置设置一个用于加液的圆孔，所述圆孔的直径为0.45～0.75cm；所述滤板还设置若干个相互平行的条形筛条，每两个相邻筛条之间形成长方形筛孔，所述筛孔的宽为0.15～0.25cm；(2)通过步骤(1)所述圆孔向离心管中加入细胞分离液，所述细胞分离液的添加量以没过滤板为标准；(3)将新鲜的胎盘组织消化液加入到离心管中，1000～2000rpm离心10～30min，实现组织消化液的分层；(4)倒掉滤板上层消化液，穿过圆孔吸取滤板下的含有胎盘间充质干细胞的细胞分离液。

【技术特征摘要】
1.一种胎盘间充质干细胞的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取离心管，在垂直于离心管轴线的平面上放置一片滤板，使滤板下方的离心管容积占离心管总容积的20～40％，所述滤板的中心位置设置一个用于加液的圆孔，所述圆孔的直径为0.45～0.75cm；所述滤板还设置若干个相互平行的条形筛条，每两个相邻筛条之间形成长方形筛孔，所述筛孔的宽为0.15～0.25cm；(2)通过步骤(1)所述圆孔向离心管中加入细胞分离液，所述细胞分离液的添加量以没过滤板为标准；(3)将新鲜的胎盘组织消化液加入到离心管中，1000～2000rpm离心10～30min，实现组织消化液的分层；(4)倒掉滤板上层消化液，穿过圆孔吸取滤板下的含有胎盘间充质干细胞的细胞分离液。2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤(2)中细胞分离液为添加有5～15％体积含量胎牛血清和20～60g/L葡聚糖的DMEM培养基。3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤(3)中胎盘组织消化液的制备方法包括如下步骤：①将胎盘组织置于质量体积比为0.1～0.3％g/ml的胰蛋白酶溶液中，预消化10～20min，得到预消化后的胎盘组织；②将所述预消化后的胎盘组织剪碎，得到单个体积为1～2mm3的肉糜...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾在美，黄玉香，刘超，姜磊，刘艳妍，
申请(专利权)人：青岛奥克生物开发有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37