一种培养免疫细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种培养免疫细胞的方法，属于肿瘤治疗技术领域，将来源于腹腔液的单个核细胞培养得到免疫细胞；所述免疫细胞包括NK细胞和/或CIK细胞。采用本发明专利技术提供的方法培养得到免疫细胞，不仅利用了病理废弃物腹腔液，而且减少了利用外周血培养免疫细胞给患者造成的二次刺激。

A method of culturing immune cells

【技术实现步骤摘要】
一种培养免疫细胞的方法
本专利技术属于肿瘤治疗
，尤其涉及一种培养免疫细胞的方法。
技术介绍
目前NK和CIK前体细胞主要来源于人外周血分离的单个核细胞，对于肿瘤患者经过放化疗后，外周血淋巴细胞核DNA及细胞免疫功能都会有一定程度的损伤，此时，采取患者外周血是对患者的二次刺激。大多数肿瘤患者后期会产生腹腔液，临床上一般会采取放腹水的方式减轻肿瘤患者的病症。目前现有腹水的用途主要有以下几个方面：(1)利用临床细胞学检验腹水，鉴别腹水性质，从而诊断癌症。(2)从腹水中分离鉴定exosomes是肿瘤免疫治疗的基础。(3)从肿瘤患者腹腔液中分离癌细胞，为免疫细胞与癌细胞共培养提供试验基础。(4)从卵巢肿瘤患者中分离具有免疫活性的DC(树突状细胞)前体细胞。(5)回收胸腹水中有效成分，制备自体蛋白和TIL(肿瘤浸润淋巴细胞)，其中自体蛋白通过静脉回输为患者提供营养支持，同时可改变腹体渗透压从而抑制腹水的产生，TIL在N-IL-2诱导下，成为LAK(淋巴因子激活的杀伤细胞)细胞，对肿瘤细胞产生杀伤作用。目前未有分离腹水中单个核细胞，进而培养成NK和CIK细胞进行肿瘤免疫细胞治疗的方案。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种培养免疫细胞的方法，采用本专利技术提供的方法培养得到免疫细胞，不仅利用了病理废弃物腹腔液，而且减少了利用外周血培养免疫细胞给患者造成的二次刺激。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：本专利技术提供了一种培养免疫细胞的方法，将来源于腹腔液的单个核细胞培养得到免疫细胞；所述免疫细胞包括NK细胞和/或CIK细胞。优选的，当所述免疫细胞为NK细胞时，将上述技术方案所述的单个核细胞与NK细胞培养液、质量百分含量为8～12％的胎牛血清溶液、饲养细胞混合后，得到混合物，将所述混合物培养14d，得到NK细胞。优选的，所述单个核细胞的数量与NK细胞培养液的体积、质量百分含量为8～12％的胎牛血清溶液的体积、饲养细胞的数量比为2.5～3.5×107cells:16～23ml:1.6～2.3ml:1.8～2.2×107cells。优选的，所述混合物接种于细胞培养瓶中进行培养，所述单个核细胞的接种密度为0.5～1.5×106cells/ml。优选的，当使用培养瓶培养时，培养第4d时，更换培养瓶，所述单个核细胞的接种密度为1.2～1.8×106cells/ml，第4d至第6d维持细胞密度为1.2～1.8×106cells/ml。优选的，第7d时，往培养瓶中添加饲养细胞，饲养细胞的添加量为7.2～8.8×107cells/瓶。优选的，当所述免疫细胞为CIK细胞时，将权利要求1所述的单个核细胞与CIK培养液混合后，将得到的混合物在37℃、5％CO2下进行培养13d，得到CIK细胞。优选的，所述混合物接种于培养瓶中培养，所述培养瓶的规格为175cm2。优选的，培养24h后，向培养瓶中添加CD3McAb、IL-2和IL-1α，使CD3McAb的终浓度为90～110ng/ml，IL-2的终浓度为900～1100U/ml，IL-1α的终浓度为900～1100U/ml。优选的，培养第8d时，收集细胞，将细胞转入培养袋中培养，每袋培养袋中含有180～220ml的CIK培养液；培养第10d时，每袋培养袋中补加380～420ml的CIK培养液；培养第12d时，每袋培养袋中补加180～220ml的CIK培养液。本专利技术提供了一种培养免疫细胞的方法，将来源于腹腔液的单个核细胞培养得到免疫细胞；所述免疫细胞包括NK细胞和/或CIK细胞。采用本专利技术提供的方法培养得到免疫细胞，不仅利用了病理废弃物腹腔液，而且减少了利用外周血培养免疫细胞给患者造成的二次刺激。附图说明图1为单个核细胞分离结果，其中A为1500g离心得到的腹腔液，B为淋巴细胞分离液分离的单个核细胞；图2为流式细胞术检测腹腔液中淋巴细胞的比例，其中A、B为对照，C-H为荧光单克隆抗体标记；图3为NK细胞培养结果，其中A为培养第2d，B为培养第9d；图4为NK细胞的流式分析结果图，其中A、B为对照，C-E为荧光单克隆抗体标记；图5为CIK细胞培养结果，其中A为培养第2d，B为培养第5d；图6为CIK细胞的流式分析结果图，其中A、B为对照，C-E为荧光单克隆抗体标记。具体实施方式本专利技术提供了一种培养免疫细胞的方法，将来源于腹腔液的单个核细胞培养得到免疫细胞；所述免疫细胞包括NK细胞和/或CIK细胞。在本专利技术中，所述腹腔液优选为卵巢癌患者的腹腔液。本专利技术对从腹腔液中分离得到单个核细胞的方法没有特殊限定，采用常规方法即可，在本专利技术具体实施方式中，优选包括以下步骤：1)将卵巢癌患者的腹腔液在4℃、1500g下离心10min，得到沉淀；2)将所述步骤1)得到的第一沉淀经生理盐水重悬，得到重悬液，将所述重悬液添加到淋巴细胞分离液表面，在2200rpm下离心20min，收集单个核细胞层，将所述单个核细胞层与生理盐水婚后后在810g下离心7min，得到的沉淀为单个核细胞。本专利技术对所述淋巴细胞分离液的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。在本专利技术中，当所述免疫细胞为NK细胞时，将上述技术方案所述的单个核细胞与NK细胞培养液、质量百分含量为8～12％的胎牛血清溶液、饲养细胞混合后，得到混合物，将所述混合物培养14d，得到NK细胞。在本专利技术中，所述单个核细胞的数量与NK细胞培养液的体积、质量百分含量为8～12％的胎牛血清溶液的体积、饲养细胞的数量比为2.5～3.5×107cells:16～23ml:1.6～2.3ml:1.8～2.2×107cells。本专利技术对所述NK细胞培养液的来源没有特殊限定，采用常规培养得到NK细胞的NK细胞培养液即可，如CorningKBM58188-581-CM淋巴细胞无血清培养基(康宁)，KBM58188-581-CM淋巴细胞无血清培养基添加终浓度为10％(体积比)的胎牛血清和终浓度为200U/ml的IL-2后使用。在本专利技术中，所述饲养细胞优选为中赢K562工程细胞。K562细胞上表达的膜蛋白，通过细胞间的接触刺激，用以诱导NK细胞扩增。IL-2对NK诱导NK细胞的分化和效应功能，并诱导杀伤细胞产生IFN-γ、TNF-α等细胞因子。在本专利技术中，所述混合物接种于细胞培养瓶中进行培养，所述培养瓶的规格优选为75cm2，所述单个核细胞的接种密度优选为0.5～1.5×106cells/ml，更优选为1×106cells/ml。在本专利技术中，所述培养瓶促进肿瘤细胞贴壁，将NK细胞与肿瘤细胞初步分离。在本专利技术中，当使用培养瓶培养时，培养第4d时，更换培养瓶，所述单个核细胞的接种密度优选为1.2～1.8×106cells/ml，更优选为1.5×106cells/ml；第4d至第6d优选维持细胞密度为1.2～1.8×106cells本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种培养免疫细胞的方法，其特征在于，将来源于腹腔液的单个核细胞培养得到免疫细胞；/n所述免疫细胞包括NK细胞和/或CIK细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种培养免疫细胞的方法，其特征在于，将来源于腹腔液的单个核细胞培养得到免疫细胞；
所述免疫细胞包括NK细胞和/或CIK细胞。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述免疫细胞为NK细胞时，将权利要求1所述的单个核细胞与NK细胞培养液、质量百分含量为8～12％的胎牛血清溶液、饲养细胞混合后，得到混合物，将所述混合物培养14d，得到NK细胞。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述单个核细胞的数量与NK细胞培养液的体积、质量百分含量为8～12％的胎牛血清溶液的体积、饲养细胞的数量比为2.5～3.5×107cells:16～23ml:1.6～2.3ml:1.8～2.2×107cells。


4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述混合物接种于细胞培养瓶中进行培养，所述单个核细胞的接种密度为0.5～1.5×106cells/ml。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，当使用培养瓶培养时，培养第4d时，更换培养瓶，所述单个核细胞的接种密度为1.2～1.8×106cells/ml，第4d至第6d维持细胞密度为1.2～1.8×106cells/ml。

【专利技术属性】
技术研发人员：贾在美，黄玉香，王芮，刘超，姜磊，李文菁，
申请(专利权)人：青岛奥克生物开发有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37