一种间充质干细胞预处理方法技术

本发明专利技术提供了一种间充质干细胞预处理方法，该方法包括以下步骤：(1)在间充质干细胞在细胞收获前12‑20h，向培养基中加入TNF‑α因子、IL‑β因子、三七总皂苷注射液、低分子肝素盐进行诱导处理；(2)将诱导完成的间充质干细胞用胰蛋白酶进行消化，然后终止消化，离心，收集沉淀，对沉淀进行重悬，清洗，最后保存。诱导处理时加入的TNF‑α因子、IL‑β因子、三七总皂苷注射液和低分子肝素盐，其结合能提高间充质干细胞的黏附能力和迁移能力，且能够减轻钙离子超载抑制细胞凋亡，从而提高间充质干细胞的存活率，进而提高临床作用效果。

【技术实现步骤摘要】
一种间充质干细胞预处理方法
本专利技术属于间充质干细胞
，具体涉及一种间充质干细胞预处理方法。
技术介绍
间充质干细胞基于其自我复制和增殖分化的潜能被广泛应用于临床治疗研究，但治疗效果各有差异，甚至不乏临床治疗无效的案例。病理部位组织通常与缺血、细胞外基质(ECM)降解、氧化应激、验证和急性免疫反应有关，大量实验证明，间充质干细胞临床治疗通常显示出有限的存活率和损伤组织低保留率，从而降低了临床治疗效果。有研究表明通过低氧预处理能一定程度上增强临床应用中干细胞机体中的存活率和组织部位的滞留率，其缺点是参数较不易控制。如何降低细胞治疗中细胞的死亡率，提高细胞的适应能力及其迁移、黏附等功能是保证临床治疗效果的关键。因此，开发一种有助于提高间充质干细胞存活率，安全有效的间充质干细胞处理方法是十分有利的。
技术实现思路
针对现有技术中存在的上述问题，本专利技术提供一种间充质干细胞预处理方法，该方法可提高间充质干细胞的存活率，增强细胞的黏附及迁移功能。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种间充质干细胞预处理方法，包括以下步骤：(1)在间充质干细胞收获前12-20h，向培养基中加入TNF-α因子、IL-β因子、三七总皂苷注射液、低分子肝素盐进行诱导处理；其中，TNF-α因子、IL-β因子、三七总皂苷注射液、低分子肝素盐的终浓度为3-6ng/mL、3-6ng/mL、5-10mg/mL、2-5U/mL；(2)将诱导完成的间充质干细胞用胰蛋白酶消化，然后终止消化，离心，收集沉淀，对沉淀进行重悬，清洗，最后保存。进一步地，步骤(1)中在间充质干细胞收获前12h进行诱导处理。进一步地，步骤(1)中TNF-α因子、IL-β因子、三七总皂苷注射液、低分子肝素盐的终浓度为5ng/mL、5ng/mL、8mg/mL、4U/mL。进一步地，步骤(1)中低分子肝素盐为低分子肝素钠或低分子肝素钙。进一步地，步骤(2)具体过程为：将诱导完成的间充质干细胞用0.25％的胰蛋白酶消化2-3min，然后用含10％血清的DMEM高糖培养基终止消化，离心，收集沉淀，用生理盐水进行重悬，然后清洗，最后置于保存介质中进行保存。进一步地，保存介质为生理盐水和人血白蛋白注射液按体积比为1:99混合的混合物。进一步地，培养间充质干细胞的培养基为含10％血清的DMEM高糖培养基，培养条件为37℃，5％CO2。本专利技术提供的间充质干细胞预处理方法，具有以下有益效果：在间充质干细胞培养过程中，在收获前12-20个小时内对其进行诱导处理，诱导处理时加入的TNF-α因子、IL-β因子、三七总皂苷注射液能提高间充质干细胞的黏附能力和迁移能力，且能够减轻钙离子超载抑制细胞凋亡，从而提高间充质干细胞的存活率。此外，低分子肝素盐的加入可以降低细胞在治疗过程中出现的成团栓塞现象，提高治疗稳定性，同时，低分子肝素盐与TNF-α因子、IL-β因子、三七总皂苷注射液结合，提高细胞应用过程中的成活率，提高细胞的迁移能力，增加达到靶细胞的细胞比例，进而提高临床作用效果。附图说明图1为诱导处理组和对照组的间充质干细胞形态图。图2为间充质干细胞流式结果图。图3为间充质干细胞生长曲线图。图4为间充质干细胞的三向分化图。图5为间充质干细胞的划痕实验结果图。图6为间充质干细胞划痕实验后细胞迁移距离结果。具体实施方式实施例1脐带间充质干细胞的制备(1)选取健康足月胎儿的脐带，于生物安全柜中进行无菌清洗后，剥离脐带华通氏胶，然后用无菌手术剪将其剪成1-3mm的小块，加入含10％血清的DMEM高糖培养基重悬培养，并加入3％三抗溶液混匀，晃动细胞培养瓶，使得组织块在培养瓶中均匀分布，然后置于37℃，5％CO2培养箱中培养；(2)每隔5-8天换一次培养液，直至细胞爬出，待细胞达到传到数量后进行传代培养；(3)弃去培养原液及组织块，加入无菌生理盐水清洗一次，然后加入0.25％胰蛋白酶进行消化；(4)消化完成后加入新鲜的培养基终止消化，吹打细胞成单个细胞悬液，室温下于1200r/min条件下离心3min；(5)去掉离心上清液，弹散细胞沉淀，取样计数，按照5000-8000个/T175的密度进行接种扩大培养。实施例2诱导处理诱导处理组1：待细胞传代至P3代时，在收获细胞前12h，加入TNF-α因子、IL-β因子、三七总皂苷注射液和注射用低分子量肝素钠(万邦医药)进行诱导处理，直至收获细胞，将诱导完成的间充质干细胞用0.25％的胰蛋白酶进行消化2-3min，然后用含10％血清的DMEM高糖培养基终止消化，离心，收集沉淀，用生理盐水进行重悬，然后清洗，最后置于保存介质中进行保存，保存介质为生理盐水和人血白蛋白注射液按体积比为1:99混合的混合物，所得细胞记为样本1；其中TNF-α因子、IL-β因子、三七总皂苷注射液和注射用低分子量肝素钠(万邦医药)的终浓度为5ng/mL、5ng/mL、8mg/mL、4U/mL。诱导处理组2：待细胞传代至P3代时，在收获细胞前15h，加入TNF-α因子、IL-β因子、三七总皂苷注射液和注射用低分子量肝素钠进行诱导处理，直至收获细胞，将诱导完成的间充质干细胞用0.25％的胰蛋白酶进行消化2-3min，然后用含10％血清的DMEM高糖培养基终止消化，离心，收集沉淀，用生理盐水进行重悬，然后清洗，最后置于保存介质中进行保存，保存介质为生理盐水和人血白蛋白注射液按体积比为1:99混合的混合物，所得细胞记为样本2；其中TNF-α因子、IL-β因子、三七总皂苷注射液和注射用低分子量肝素钠的终浓度为3ng/mL、3ng/mL、5mg/mL、2U/mL。诱导处理组3：待细胞传代至P3代时，在收获细胞前20h，加入TNF-α因子、IL-β因子、三七总皂苷注射液和注射用低分子量肝素钠进行诱导处理，直至收获细胞，将诱导完成的间充质干细胞用0.25％的胰蛋白酶进行消化2-3min，然后用含10％血清的DMEM高糖培养基终止消化，离心，收集沉淀，用生理盐水进行重悬，然后清洗，最后置于保存介质中进行保存，保存介质为生理盐水和人血白蛋白注射液按体积比为1:99混合的混合物，所得细胞记为样本3；其中TNF-α因子、IL-β因子、三七总皂苷注射液和注射用低分子量肝素钠的终浓度为6ng/mL、6ng/mL、10mg/mL、5U/mL。对照组：按照常规方式培养，不经过诱导处理。对收获的细胞进行检测，具体内容为检测细胞形态、活率保持情况、流式检测、生长曲线检测、三向分化检测、细胞周期检测。1、细胞形态在光学显微镜下观察诱导处理组和对照组的细胞，细胞均呈梭形或多角形贴壁生长状态，均为成纤维细胞样的典型形态，细胞核清晰，边界清晰，细胞生长状况无异常，结果见图1。图1中1-1为样本1的细胞图片，1-2为样本2的细胞图片，1-3为样本3的细胞图片，1-4为对照组的细胞图片。由图1可知，经过诱导后的间充质干细胞不会对细胞形态造成不良影响。2、细胞存活率样本1样本2样本3对照组细胞存活率99.24％98.78％96.50％92.83％3、细胞表面标志物检测(1)取P3代细胞，用生理盐水稀释至1×106个/mL的细胞悬液；(2)分别吸取抗CD73、CD90、CD105、CD11b、CD19、CD34、CD45、HL本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种间充质干细胞预处理方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)在间充质干细胞收获前12‑20h，向培养基中加入TNF‑α因子、IL‑β因子、三七总皂苷注射液、低分子肝素盐进行诱导处理；其中，TNF‑α因子、IL‑β因子、三七总皂苷注射液、低分子肝素盐的终浓度为3‑6ng/mL、3‑6ng/mL、5‑10mg/mL、2‑5U/mL；(2)将诱导完成的间充质干细胞用胰蛋白酶消化，然后终止消化，离心，收集沉淀，对沉淀进行重悬，清洗，最后保存。

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞预处理方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)在间充质干细胞收获前12-20h，向培养基中加入TNF-α因子、IL-β因子、三七总皂苷注射液、低分子肝素盐进行诱导处理；其中，TNF-α因子、IL-β因子、三七总皂苷注射液、低分子肝素盐的终浓度为3-6ng/mL、3-6ng/mL、5-10mg/mL、2-5U/mL；(2)将诱导完成的间充质干细胞用胰蛋白酶消化，然后终止消化，离心，收集沉淀，对沉淀进行重悬，清洗，最后保存。2.根据权利要求1所述的间充质干细胞预处理方法，其特征在于，步骤(1)中在间充质干细胞收获前12h进行诱导处理。3.根据权利要求1所述的间充质干细胞预处理方法，其特征在于，步骤(1)中TNF-α因子、IL-β因子、三七总皂苷注射液、低分子肝素盐的终浓度为5ng/...

【专利技术属性】
技术研发人员：高雪华，海泉，陈静娴，
申请(专利权)人：成都清科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51