用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存体系、方法及试剂盒技术

本发明专利技术实施例公开了一种用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存体系，所述培养冻存体系包括牙髓干细胞提取试剂、牙髓干细胞培养试剂以及牙髓干细胞保存试剂，其中，所述培养试剂包括牙髓干细胞原代培养液、牙髓干细胞传代培养液以及牙髓干细胞消化液。本发明专利技术实施例还提供用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存试剂盒及方法。本发明专利技术实施例用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存体系囊括了牙髓干细胞从牙齿保存运输到牙髓干细胞冻存的所有过程，牙髓干细胞储存操作简便，能获得大量、高纯度的牙髓干细胞，本发明专利技术实施例的用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存体系减少了多配试剂造成的资源浪费，又降低了与其他样本交叉污染的风险。

【技术实现步骤摘要】
用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存体系、方法及试剂盒
本专利技术实施例涉及干细胞培养
，具体涉及一种用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存体系、方法及试剂盒。
技术介绍
牙周炎是累及四种牙周支持组织的慢性感染性疾病，往往引发牙周支持组织的炎性破坏。常见病因为菌斑、牙石、创伤性咬合、食物嵌塞、不良修复体、口呼吸等。牙周炎具有四大特征，即牙周袋形成、袋壁的炎症、牙槽骨吸收、牙齿逐渐松动。严重的牙周炎会造成牙齿脱落，从而导致咀嚼功能低下而引起消化不良及胃肠病，影响全身心的健康。治疗牙周炎的主要在于消除炎症，促进被破坏的牙周组织的再生，恢复牙齿的正常功能。临床常采用的牙周炎治疗方法包括：牙周基础治疗、牙周翻瓣术及牙周组织再生术。但这些方法无法修复损伤的牙周附着及牙槽组织，不能满足目前临床上对口腔颌面部组织缺损修复再生及功能、外形恢复的要求，其次牙周炎治疗通过抗生素来控制菌斑生长，进行全身和局部的药物治疗。但抗生素副作用较多，病原微生物也会产生耐药性。牙髓干细胞(dentalpulpstemcells，DPSCs)是存在于牙齿牙髓组织中的一类具有自我更新、增殖能力强，及多向分化能力的间充质干细胞。牙髓干细胞具有多向分化的潜能，它除了能形成矿化结节能力的细胞外，经过不同细胞因子的诱导，还能够分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、血管内皮、肝、神经等细胞系类型。据报道，牙髓干细胞在牙周炎治疗中可起到很好的修复作用，作用机制为：通过植入局部并分化为缺损细胞，分泌细胞因子，趋化干细胞到局部，抑制局部炎症，促进局部血管新生。牙髓干细胞的保存对于能够利用干细胞来治疗疾病的越来越多，干细胞疗法将应用于人体所有的器官及功能，并对症下药。将牙髓干细胞注射至损伤部位或者修复受损伤的细胞和组织，是受伤的组织恢复正常，干细胞分泌生物活性物质，抑制病变部位的炎症并促进局部血管新生。目前，常用的牙髓干细胞提取方法为采用I型胶原酶或者I型胶原酶与中性蛋白酶消化牙髓组织。但该法得到的牙髓干细胞总数量少，细胞活率低，而且，无有效的便利的提取及扩增培养冻存体系。
技术实现思路
为此，本专利技术实施例提供一种用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存体系、方法及试剂盒，以解决现有技术中由于样本量少、样本来源不同而导致的试剂浪费、交叉污染的问题。为了实现上述目的，本专利技术的实施方式提供如下技术方案：一种用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存体系，所述培养冻存体系包括牙髓干细胞提取试剂、牙髓干细胞培养试剂以及牙髓干细胞保存试剂，其中，所述培养试剂包括牙髓干细胞原代培养液、牙髓干细胞传代培养液以及牙髓干细胞消化液。优选的，所述牙髓干细胞原代培养液包括α-MEM培养基、体积分数为20％的胎牛血清、摩尔浓度为2mM/L的L-谷氨酰胺、0.25mg/ml的两性霉素B、0.1mM/L的L-抗坏血酸-2磷酸钠、100IU/ml青霉素，100IU/ml链霉素。优选的，所述牙髓干细胞传代培养液为无血清培养基，100IU/ml青霉素，100IU/ml链霉素。优选的，所述牙髓干细胞提取试剂包括牙髓组织消化液、牙髓组织消化液激活液以及牙髓组织消化液终止液；其中，所述牙髓组织消化液包括3mg/ml胶原酶I、4mg/ml中性蛋白酶；所述牙髓组织消化液激活液包括CaCl2溶液，MgSO4溶液；所述牙髓组织消化终止液为α-MEM培养基，其包含体积分数为5％的胎牛血清。优选的，所述牙髓干细胞保存试剂包括：牙髓干细胞保存原液和牙髓干细胞保存稀释液；其中，所述牙髓干细胞保存原液包括DMSO溶液；所述牙髓干细胞保存稀释液包括完全无血清培养基，其添加有100IU/ml青霉素，100IU/ml链霉素。优选的，本专利技术实施例的用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存体系，还包括牙齿储存清洁试剂，所述牙齿储存清洁试剂包括牙齿保存液、牙齿清洁液；其中，所述牙齿保存液为α-MEM培养基；所述牙齿清洁液为0.9％生理盐水。优选的，所述无血清培养基还包含体积分数2％的血清替代品，2mM/L的L-谷氨酰胺。本专利技术实施提供一种用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存试剂盒，包括上述所述的用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存体系。本专利技术实施例再提供一种体外扩增牙髓干细胞的培养冻存方法，其包括以下步骤：清洁牙齿：将取出的牙齿放入牙齿保存液，并牙齿清洁液浸泡1-3min，清除牙龈组织及血块；分离牙髓干细胞：用牙髓组织消化液消化粉碎的牙髓组织，加入牙髓组织消化液激活液，37℃下，振荡30-40min后，加入牙髓组织消化终止液，重悬牙髓干细胞液；培养扩增牙髓干细胞：将牙髓干细胞液离心分离牙髓干细胞，加入牙髓干细胞原代培养液，在37℃，5％CO2环境中培养；当牙髓干细胞融合80-90％时，将牙髓干细胞传代至P1代，用生理盐水洗涤牙髓干细胞2次，用牙髓干细胞消化液消化牙髓干细胞后，离心分离牙髓干细胞，用牙髓干细胞传代培养液重悬，继续培养至牙髓干细胞融合90％时，按照6000-8000个/cm2的密度传代至P2代牙髓干细胞；保存牙髓干细胞：将P2代牙髓干细胞清洗2次，牙髓干细胞消化液处理后，离心分离牙髓干细胞，用牙髓干细胞保存液保存。优选的，所述牙髓干细胞按照1-3×106个/ml的密度保存于液氮中。本专利技术的用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存体系具有如下优点：本专利技术实施例用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存体系囊括了牙髓干细胞从牙齿保存运输到牙髓干细胞冻存的所有过程，牙髓干细胞储存操作简便，能获得大量、高纯度的牙髓干细胞，本专利技术实施例的用于体外扩增牙髓干细胞的培养体系减少了多配试剂造成的资源浪费，又降低了与其他样本交叉污染的风险，为后期牙髓干细胞在临床治疗疾病以及再生医学领域研究提供可靠保证。附图说明为了更清楚地说明本专利技术的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。图1A-图1I为本专利技术实施例提供的利用本专利技术实施例提供的用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存体系获得的P2代细胞进行流式细胞检测仪器的检测结果图；其中，图1A表示牙髓干细胞流式结果散点图分布，圈住的区域为牙髓干细胞，细胞纯度较高；图1B表示采用FITC染料进行染色，灰色区域为阴性对照，黑色为本专利技术实施例的牙髓干细胞，灰色与黑色区域基本重合，CD45阳性值为0.011％，CD45表达阴性，符合间充质干细胞表达要求；图1C表示采用PerCP染料进行染色，灰色区域为阴性对照，黑色为本专利技术实施例的牙髓干细胞，灰色与黑色区域基本重合，CD34阳性细胞值为0％，CD34表达阴性，符合间充质干细胞表达要求；图1D表示采用PE染料进行染色，灰色区域为阴性对照，黑色为本专利技术实施例的牙髓干细胞，灰色与黑色区域基本重合，HLA-DR阳性值为0.011％，HLA-DR表达阴性，符合间充质干细胞表达要求；图1E表示采用PE染料进行染色，灰色区域为阴性对照，黑色为本专利技术实施例的牙髓干细胞，灰色与黑色区域基本重合，CD19阳性值为0.016％，CD19表达阴性，符合间充质干细胞表达要求；图1F表示采用FITC染料进行染色，灰色区域为阴性对照，黑色为本专利技术实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存体系，其特征在于，所述培养冻存体系包括牙髓干细胞提取试剂、牙髓干细胞培养试剂以及牙髓干细胞保存试剂，其中，所述培养试剂包括牙髓干细胞原代培养液、牙髓干细胞传代培养液以及牙髓干细胞消化液。

【技术特征摘要】
1.一种用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存体系，其特征在于，所述培养冻存体系包括牙髓干细胞提取试剂、牙髓干细胞培养试剂以及牙髓干细胞保存试剂，其中，所述培养试剂包括牙髓干细胞原代培养液、牙髓干细胞传代培养液以及牙髓干细胞消化液。2.如权利要求1所述的用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存体系，其特征在于，所述牙髓干细胞原代培养液包括α-MEM培养基、体积分数为20％的胎牛血清、摩尔浓度为2mM/L的L-谷氨酰胺、0.25mg/ml的两性霉素B、0.1mM/L的L-抗坏血酸-2磷酸钠、100IU/ml青霉素，100IU/ml链霉素。3.如权利要求1所述的用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存体系，其特征在于，所述牙髓干细胞传代培养液为无血清培养基，100IU/ml青霉素，100IU/ml链霉素。4.如权利要求1所述的用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存体系，其特征在于，所述牙髓干细胞提取试剂包括牙髓组织消化液、牙髓组织消化液激活液以及牙髓组织消化液终止液；其中，所述牙髓组织消化液包括3mg/ml胶原酶I、4mg/ml中性蛋白酶；所述牙髓组织消化液激活液包括CaCl2溶液，MgSO4溶液；所述牙髓组织消化终止液为α-MEM培养基，其包含体积分数为5％的胎牛血清。5.如权利要求1所述的用于体外扩增牙髓干细胞的培养冻存体系，其特征在于，所述牙髓干细胞保存试剂包括：牙髓干细胞保存原液和牙髓干细胞保存稀释液；其中，所述牙髓干细胞保存原液包括DMSO溶液；所述牙髓干细胞保存稀释液包括完全无血清培养基，其添加有100IU/ml青霉素，100IU/ml链霉素。6.如权利要求1所述的用于...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈力坚，李明辉，王健，徐云龙，侯志勇，周书行，弓培，翟珊莉，
申请(专利权)人：北京博奥晶典启衡生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11