一种多粘类芽孢杆菌发酵物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种多粘类芽孢杆菌发酵物及其制备方法和应用。该发酵物的制备方法包括：对菌种依次进行活化、种子培养和发酵培养，经离心、浓缩后，得到多粘类芽孢杆菌发酵物；所述发酵物为菌膜和多粘类芽孢杆菌孢子体的混合物；所述菌种为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus poly myxa)ZJU‑N。本发明专利技术通过选择特定的多粘类芽孢杆菌、改变种子培养基和发酵培养基的组分类型和用量进行发酵，能够得到富含菌膜和多粘类芽孢杆菌孢子体的发酵产物，并用于制备孢子体微囊和孢子体微囊悬浮剂，防治水稻的纹枯病、稻曲病和恶苗病。

A Bacillus polymyxa fermentation product and its preparation method and Application

The invention discloses a Bacillus polymyxa fermentation product, a preparation method and application thereof. The preparation method of the fermentation product includes: activation of the strain, seed culture and fermentation culture in turn, centrifugation and concentration, and then the fermentation product of Bacillus poly myxa is obtained; the fermentation product is a mixture of bacterial membrane and Sporophyte of Bacillus poly myxa; and the strain is Paenibacillus poly myxa ZJU_N. By selecting specific Bacillus polymyxoides, changing the type and amount of components of seed medium and fermentation medium, the fermentation product rich in bacterial membrane and Sporophyte of Bacillus polymyxoides can be obtained, and used to prepare sporophyte microcapsules and sporophyte microcapsule suspension agent to prevent rice sheath blight, Rice False Smut and cachexia.

【技术实现步骤摘要】
一种多粘类芽孢杆菌发酵物及其制备方法和应用
本专利技术涉及农作物病害生物防治
，尤其涉及一种多粘类芽孢杆菌发酵物及其制备方法和应用。
技术介绍
生物农药是指:“利用生物活体或其代谢产物对害虫、病菌、杂草等有害生物进行防治的一类农药制剂，或者是通过生物技术或仿生合成具有农药功能的生物制品”。在农药登记管理中生物农药概念通常是狭义的，主要指昆虫天敌、植物源农药、微生物农药和转基因生物。日前，国内化学农药虽发挥了重要作用，但环境污染问题越来越突出，生物农药的绿色发展是粮食安全、生态安全和环境安全的需要，同时能进一步减少病虫草害抗药性的发生。多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)是一类产芽孢的革兰氏阳性细菌，类芽孢杆菌属，分布广泛，不仅存在土壤、植物根系和体表，而且也是植物体内常见的内生细菌。多粘类芽孢杆菌对植物具有非致病性，同时具有防病和促生作用，作为生防菌广泛应用在农业生产中。多粘类芽孢杆菌能在植物宿主中快速的定殖并移动，从而能与病原菌竞争空间和营养，它还能通过诱导作用提高宿主植物的抗病能力，并通过固氮和溶磷作用为宿主植物提供成分，促进植物生长。天然生物膜(菌膜)：多粘类芽孢杆菌能产生肽类、蛋白质类、核苷类和酚类等多种抗菌物质，能防治多种由病原细菌、病原真菌、根结线虫引起的植物病害，同时能形成粘性菌膜，菌膜的形成一方面可以通过调节微生物菌体的生长和繁殖来控制，另一方面也可以通过调节微生物生长过程中胞外多糖、S层蛋白的分泌来控制。菌膜作用于细菌或孢子体，易于黏附到各种靶体表面并有利定殖，可提高环境抗逆性、同时有利于孢子萌发，在抑菌活性等多方面也发挥重要的作用。人工生物膜(脂质体)：当磷脂分散在水中时能形成多层微囊，每一层均为磷脂双分子层，各层之间被水相分开，这种具有类似生物膜的磷脂双分子结构称为脂质体。由于它的结构类似于细胞，所以又称为人工生物膜。脂质体作为药物的载体具有持效作用。脂质体作为药物的储库，可使被包封药物缓慢释放，从而使药物制剂具有控释作用。制备脂质体的原料主要是类脂物质，应用较多的以植物性的大豆卵磷脂为主，其主要为不饱和脂肪酸，可以使脂质体具有较低的相转变温度，有很好的流动性和低的粘滞性，同时大豆卵磷脂作为两性表面活性物质，无毒性，受酸碱度、盐浓度的影响较小，生物兼容性好，而且本身亦具有良好的生理活性，可促性药物的透黏膜吸收，可以单独形成微乳。常规脂质体作为一种良好的载体，有着许多独特的优点，但同时也存在着一定的不足，随着时间的推移，存在着絮凝、沉降、粒径增大所导致的内容物渗透等稳定性较差的问题，限制了其在医药、农药产业中的应用。许多药物在喷施到田间，短时间内达到峰值，即被降解。由于高分子聚合物的药物载体稳定性好，用其去修饰脂质体表面，通过表面修饰过的脂质体将微生物药物包裹，可以延缓药物的排放和代谢，同时可以有效的延长微生物药物在植物中的滞留时间，从而延长药效。另一方面，改性后的脂质体能保持微生物良好的定殖能力。聚乙二醇(PEG)包覆脂质体：PEG是由乙氧基单元构成的聚醚类高聚物，是一种无毒、无副作用、环境友好的水溶性高分子聚合物。PEG-4000作为粘合剂，可提高脂质体微囊体的表面成膜性和固化强度，有利于囊体中药物释放的持效性，也是有利于保持微生物孢子体萌发活力的微环境。同时，PEG具有便宜、易得，既溶于水又溶于多种有机溶剂，具有独特的端基反应性和可修饰性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种多粘类芽孢杆菌发酵物及其制备方法和应用，该制备方法得到的发酵物富含孢子体和菌膜，可用于制备孢子体微囊和孢子体微囊悬浮剂，并用于防治水稻的纹枯病、稻曲病和恶苗病。具体技术方案如下：本专利技术提供了一种多粘类芽孢杆菌发酵物的制备方法，包括：依次进行菌种的活化、种子培养和发酵培养，经离心、浓缩后，得到多粘类芽孢杆菌发酵物；所述发酵物为菌膜和多粘类芽孢杆菌孢子体的混合物；所述菌种的命名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)ZJU-N，保藏编号为：CCTCCNO:M2018692，保藏日期为2018年10月19日；所述种子培养的培养基成分为：蔗糖10-15g/L，胰蛋白胨5-10g/L，酵母浸提物3-5g/L，牛肉膏1.5-3g/L，NaCl8-10g/L，pH7.0-7.2；所述发酵培养的培养基成分为：马铃薯220-250g/L，胰蛋白胨5-8g/L，蔗糖10-15g/L，酵母浸提物1-5g/L，牛肉膏0.5-1g/L，NaCl1-5g/L，Ca(NO3)2·4H2O0.5-2g/L，Na2HPO4.12H2O1.5-3g/L，pH7.0-7.2。上述制备方法中采用的多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)ZJU-N为水稻多功能性内生菌，寄生在水稻中，能快速在水稻中占据有利的生态位，并能与寄主植物建立共生关系，同时能够有效的抑制水稻多种病害的侵染，降低病害发生率，显著提高水稻的产量和安全性，实现水稻的健康无公害生产。多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)ZJU-N还具有生长速度快，产孢能力强的特点；更重要的是，该菌株能够高产菌膜，有利于后续孢子体微囊和悬浮剂的制备，提高悬浮剂的防治效果。本专利技术采用上述特定的多粘类芽孢杆菌菌株进行发酵处理，并通过改变种子培养基和发酵培养基中C源和N源的原料种类以及其他各营养物的组分，能使多粘类芽孢杆菌在种子液和发酵培养前期菌株的营养体呈指数型快速增长，保证了后期充足的孢子体的数量，随着发酵培养基中营养物的快速耗尽、pH升高，多粘类芽孢杆菌在稳定后期开始形成大量的孢子体和菌膜。作为优选，所述菌种活化的条件为：25～35℃下培养24～48h；更优选，28～30℃下培养36～48h。作为优选，所述种子培养的条件为：25～35℃下培养12～24h；转速为140～200rpm；更优选，28～30℃下培养18-24h；转速为150～180rpm。作为优选，所述发酵培养的条件为：25～35℃下培养48～72h；转速为250～400rpm；更优选，28～30℃下培养48～72h；转速为300～350rpm。本专利技术提供了一种利用上述制备方法制得的多粘类芽孢杆菌发酵物，该多粘类芽孢杆菌发酵物的孢子数为1010-1011个/mL。本专利技术还提供了一种孢子体微囊，以质量百分数计，由以下组分构成：多粘类芽孢杆菌发酵物100份；聚乙二醇1～10份；大豆卵磷脂1～20份；所述多粘类芽孢杆菌发酵物如上所述。本专利技术还提供了一种孢子体微囊悬浮剂，以质量百分数计，由以下组分构成：所述孢子体微囊如上所述。进一步地，所述分散剂为聚羧酸盐、有机磷酸酯和萘磺酸盐聚合物中的至少一种。进一步地，所述乳化剂为聚酯复合物、有机磷酸酯、EO/PO嵌段聚醚、蓖麻油聚氧乙烯醚，脂肪醇聚氧乙烯醚、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯和失水山梨醇脂肪酸酯中的至少一种。进一步地，所述助悬剂为膨润土、白炭黑和硅酸镁铝中的至少一种。本专利技术还提供了孢子体微囊悬浮剂在制备防治水稻纹枯病、稻曲病和水稻恶苗病药剂中的应用。进一步地，所述孢子体微囊悬浮剂的施用量为30-300ml。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：(1)本专利技术制备方法通过选择特定的多粘类芽孢杆菌、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多粘类芽孢杆菌发酵物的制备方法，其特征在于，包括：对菌种依次进行活化、种子培养和发酵培养，经离心、浓缩后，得到多粘类芽孢杆菌发酵物；所述发酵物为菌膜和多粘类芽孢杆菌孢子体的混合物；所述菌种的命名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZJU‑N，保藏编号为：CCTCC NO:M2018692，保藏日期为2018年10月19日；所述种子培养的培养基成分为：蔗糖10‑15g/L，胰蛋白胨5‑10g/L，酵母浸提物3‑5g/L，牛肉膏1.5‑3g/L，NaCl 8‑10g/L，pH 7.0‑7.2；所述发酵培养的培养基成分为：马铃薯220‑250g/L，胰蛋白胨5‑8g/L，蔗糖10‑15g/L，酵母浸提物1‑5g/L，牛肉膏0.5‑1g/L，NaCl 1‑5g/L，Ca(NO3)2·4H2O 0.5‑2g/L，Na2HPO4.12H2O 1.5‑3g/L，pH7.0‑7.2。

【技术特征摘要】
1.一种多粘类芽孢杆菌发酵物的制备方法，其特征在于，包括：对菌种依次进行活化、种子培养和发酵培养，经离心、浓缩后，得到多粘类芽孢杆菌发酵物；所述发酵物为菌膜和多粘类芽孢杆菌孢子体的混合物；所述菌种的命名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)ZJU-N，保藏编号为：CCTCCNO:M2018692，保藏日期为2018年10月19日；所述种子培养的培养基成分为：蔗糖10-15g/L，胰蛋白胨5-10g/L，酵母浸提物3-5g/L，牛肉膏1.5-3g/L，NaCl8-10g/L，pH7.0-7.2；所述发酵培养的培养基成分为：马铃薯220-250g/L，胰蛋白胨5-8g/L，蔗糖10-15g/L，酵母浸提物1-5g/L，牛肉膏0.5-1g/L，NaCl1-5g/L，Ca(NO3)2·4H2O0.5-2g/L，Na2HPO4.12H2O1.5-3g/L，pH7.0-7.2。2.如权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌发酵物的制备方法，其特征在于，所述菌种活化的条件为：25～35℃下培养24～48h。3.如权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌发酵物的制备方法，其特征在于，所述种子培养的条件为：25～35℃下培养12～24h；转速为140～200rpm。4.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：林婷，陈梦丽，乔丽雅，朱瞬瞬，胡斌，谢烽，朱国念，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33