一种制备脐带间充质干细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种制备脐带间充质干细胞的方法，包括以下步骤：S1、采集脐带样本；S2、去除脐带上皮组织，充分暴露内部的华通氏胶；S3、去除脐带动静脉，制取华通氏胶；S4、组织贴壁处理，将华通氏胶贴到细胞培养皿中；S5、置CO2培养箱中培养，获得脐带间充质干细胞。由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明专利技术的优点是：本方法将脐带上皮细胞层去除，充分暴露富含脐带间充质干细胞的华通氏胶，剪成小块后无论怎么贴，都是新鲜粘稠的华通氏胶创面，操作简单，易贴壁，也有利于脐带间充质细胞爬出。

A Method for Preparing Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells

The invention provides a method for preparing umbilical cord mesenchymal stem cells, which includes the following steps: S1, collecting umbilical cord samples; S2, removing umbilical cord epithelial tissue, fully exposing the internal Walton's glue; S3, removing umbilical cord arteries and veins, preparing Walton's glue; S4, tissue adherence treatment, sticking Walton's glue to cell culture dish; S5, culturing in CO2 incubator, obtaining umbilical cord mesenchymal. Stem cells. Compared with the existing technology, the advantages of the present invention are as follows: the method removes the umbilical cord epithelial cell layer, fully exposes the Walton's glue rich in umbilical cord mesenchymal stem cells, cuts into small pieces and pastes them anyway, all of them are fresh and sticky Walton's glue wounds, which are easy to operate and adhere to, and are also conducive to the umbilical cord mesenchymal cells climbing out.

【技术实现步骤摘要】
一种制备脐带间充质干细胞的方法
本专利技术涉及细胞生物学领域。具体地说，是涉及一种制备脐带间充质干细胞的方法。
技术介绍
脐带间充质干细胞是来源于发育早期中胚层的一类具有高度自我更新能力和多向分化潜能的干细胞，可在体外分化成脂肪细胞、成骨细胞、心肌细胞、血管内皮细胞和表皮细胞等。脐带间充质干细胞因取材方便、无免疫排斥等优势而成为组织工程理想的种子来源。体外培养的间充质干细胞形态均一，平行生长或漩涡状生长，能够表达多种表面抗原，如高表达间质细胞标志(CD44、CD90、CD29)，不表达造血干细胞标志(CD34、CD45)及人白细胞抗原(HLA-DR)等。目前，脐带间充质干细胞的分离纯化技术存在易被产道菌污染及初次分离耗时太长等问题。常见脐带运输液及洗涤液多为含青链霉素，庆大霉素等抗生素的PBS缓冲液，由于抗生素的耐药菌株较多，抑菌效果不好，通常情况下会通过加大抗生素的量来提高抑菌效果，导致抗生素滥用；脐带间充质干细胞贴壁培养法分离原代细胞耗时长，组织块易脱落，有人提出用去除血管壁面贴壁法，可操作性较差，消化法跟先消化后贴壁法，细胞纯度低，而且对细胞多多少少都有一定的损伤。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述传统技术的不足之处，提供一种制备脐带间充质干细胞的方法，本方法提供的脐带运输液及洗涤液中添加了抗菌肽、匙羹藤和海藻糖，三者均为天然物质，即可有效降低细菌和真菌对细胞的污染又对人体有益无害。此外，将脐带上皮细胞层去除，可充分暴露富含间充质干细胞的华通氏胶，组织块更易贴壁，脐带间充质细胞爬出率更高。本专利技术的目的是通过以下技术措施来达到的：一种制备脐带间充质干细胞的方法，包括以下步骤：S1、采集脐带样本；S2、去除脐带上皮组织，充分暴露内部的华通氏胶；S3、去除脐带动静脉，制取华通氏胶；S4、组织贴壁处理，将华通氏胶贴到细胞培养皿中；S5、置CO2培养箱中培养，获得脐带间充质干细胞。作为一种改进：步骤S1中，采集的脐带样本置于运输液中，所述运输液包括以下组分：抗菌肽5-20ug/ml；匙羹藤50-100ug/ml；海藻糖0.5-10mg/ml；溶剂为PH6.8-7.6的PBS。抗菌肽是一类具有抗菌活性的碱性多肽物质，具有热稳定性、广谱抗菌性，对细菌有很强的杀伤作用，对常见耐药性病原菌具有同样的抑制作用，对部分病毒、真菌、原虫和癌细胞等也有杀灭作用，不仅对人体无害，甚至能提高免疫力、加速伤口愈合过程。匙羹藤是一种绿色植物，其中含有的匙羹藤酸可以有效抑制产道常见菌白色念珠菌的菌丝生长及其毒性，同样可以阻止曲霉菌属等真菌的生长，而且对金黄色葡萄球菌、变形杆菌及大肠杆菌等多种细菌也有明显抑制效果。海藻糖对生物体具有神奇的保护作用，在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活。加入运输液和洗液中可在细胞表面形成独特的保护膜，减少运输和洗涤过程中对细胞的伤害。脐带运输液及洗涤液中添加了以上三种成分，即可有效降低细菌和真菌对细胞的污染，减少对细胞的伤害，又能防止抗生素滥用，还可常温保存，且对人体有益无害。作为一种改进：步骤S1中，采集的脐带样本置于运输液前，先将脐带内的脐血排净，然后将脐带两端无菌结扎。作为一种改进：步骤S2中，去除脐带上皮的方法为，在超净台中取出脐带，用洗涤液清洗，放入装有0.05%-2%Ⅰ型胶原酶和0.01%-0.25%胰蛋白酶混合消化液中，37℃消化5-30min，取出脐带，用PBS冲洗，然后去除脐带表面的上皮组织，PBS洗净。作为一种改进：步骤S2中，去除脐带上皮组织过程中将消化处理后的脐带浸泡在无菌PBS中，用无菌细胞刮片刮除华通胶表面覆盖的一层上皮组织。作为一种改进：步骤S3中，将S2的产物制成1-2cm的片段，再用PBS洗涤，去除脐带中的两根动脉，沿着静脉将脐带剪开，刮去静脉血管壁。作为一种改进：步骤S3中，将S2的产物剪成1-2cm的片段前，先将脐带组织水肿、充血、破损及结扎处去除。作为一种改进：步骤S4中，华通氏胶贴到细胞培养皿中前，将华通氏胶用PBS充分洗涤，然后制成1-2mm3大小组织块。作为一种改进：步骤S4中，细胞培养皿先用培养液浸润一下，再将组织块均匀贴在培养皿中，间隔4-6mm，静置5-30min，每块组织上加一滴培养基。作为一种改进：步骤S5中，置CO2培养箱中，饱和湿度，5%CO2，37℃培养，3-16h后每皿补液5-8ml，第3-5天每皿补液5-10ml，第6-10天半量换液，第6天开始显微镜下观察细胞克隆情况，若细胞形态均一且数量符合预定值，需弃组织块全换液，若细胞数量不符合预定值，需继续半量换液至细胞数量符合预定值，方可弃组织块全换液，此后每2-3天换液一次，达到一定密度收获细胞。由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本专利技术的优点是：1、提供的脐带运输液及洗涤液中添加了抗菌肽，抗菌肽具有广谱抗菌活性，对细菌有很强的杀伤作用，对常见耐药性病原菌也具有同样的抑制作用，可常温存储，且对人体无毒无害，可替代青链霉素等抗生素，有效抑制细菌，减少抗生素滥用。2、脐带运输液及洗涤液中添加了匙羹藤，匙羹藤可有效抑制白色念珠菌等产道常见真菌，有效降低脐带运输和制备过程中真菌的污染概率，且对人体及细胞有益无害。3、提供的脐带运输液及洗涤液中添加了海藻糖，海藻糖可在蛋白和细胞表面形成独特的保护膜，减少脐带运输和洗涤过程中对细胞的伤害，且对人体及细胞有益无害。4、本方法将脐带上皮细胞层去除，充分暴露富含脐带间充质干细胞的华通氏胶，剪成小块后无论怎么贴，都是新鲜粘稠的华通氏胶创面，操作简单，易贴壁，也有利于脐带间充质细胞爬出。具体实施方式实施例1：一种制备脐带间充质干细胞的方法，包括以下步骤：S1、采集脐带样本，排净脐血，将脐带两端无菌结扎，采集的脐带样本置于运输液中，将装有脐带的运输瓶置于4℃恒温运输箱中运至实验室，分离干细胞前离体时间约3h。所述运输液包括以下组分：抗菌肽5ug/ml；匙羹藤50ug/ml；海藻糖0.5mg/ml；溶剂为PH6.8的PBS溶液。S2、去除脐带上皮组织：在超净台中取出脐带，在无菌平皿中用洗涤液清洗，放入装有0.05%Ⅰ型胶原酶和0.01%胰蛋白酶混合消化液中，37℃消化30min，取出脐带，用无菌PBS缓冲液反复冲洗，然后用细胞刮片刮除脐带表面的上皮组织，充分暴露内部的华通氏胶，去除脐带上皮组织过程中将脐带组织浸泡在PBS中，最后用无菌PBS将上皮组织冲洗干净。S3、去除脐带动静脉：将脐带组织两端结扎处、水肿、充血、破损处去除，然后制成1cm的片段，再用PBS洗涤2次，用眼科镊去除脐带中的两根动脉，用眼科剪沿着静脉将脐带剪开，用眼科镊刮去静脉血管壁，制取华通氏胶。S4、组织贴壁处理：用间充质干细胞培养基浸润细胞培养皿，将华通氏胶用无菌PBS洗涤，然后剪成1-2mm3大小组织块，用眼科镊将华通氏胶组织块均匀贴到细胞培养皿中，组织块与组织块间隔4mm，静置30min，每块组织上滴1滴培养基。S5、后期培养，收获细胞：置CO2培养箱中培养，饱和湿度，5%CO2，37℃，3h后每皿补液5ml，第3天每皿补液10ml，观察确定无污染，第7天半量换液，首次观察到有细胞爬出，第10天显微镜下观察本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、采集脐带样本；S2、去除脐带上皮组织，充分暴露内部的华通氏胶；S3、去除脐带动静脉，制取华通氏胶；S4、组织贴壁处理，将华通胶贴到细胞培养皿中；S5、置CO2培养箱中培养，获得脐带间充质干细胞。

【技术特征摘要】
1.一种制备脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、采集脐带样本；S2、去除脐带上皮组织，充分暴露内部的华通氏胶；S3、去除脐带动静脉，制取华通氏胶；S4、组织贴壁处理，将华通胶贴到细胞培养皿中；S5、置CO2培养箱中培养，获得脐带间充质干细胞。2.根据权利要求1所述的制备脐带间充质干细胞的方法，其特征在于：步骤S1中，采集的脐带样本置于运输液中，所述运输液包括以下组分：抗菌肽5-20ug/ml；匙羹藤50-100ug/ml；海藻糖0.5-10mg/ml；溶剂为PH6.8-7.6的PBS。3.根据权利要求1所述的制备脐带间充质干细胞的方法，其特征在于：步骤S1中，采集的脐带样本置于运输液前，先将脐带内的脐血排净，然后将脐带两端无菌结扎。4.根据权利要求1所述的制备脐带间充质干细胞的方法，其特征在于：步骤S2中，去除脐带上皮的方法为，超净台中取出脐带，用洗涤液清洗，放入装有0.05%-2%Ⅰ型胶原酶和0.01%-0.25%胰蛋白酶混合消化液中，37℃消化5-30min，取出脐带，用PBS冲洗，然后去除脐带表面的上皮组织，PBS洗净。5.根据权利要求1所述的制备脐带间充质干细胞的方法，其特征在于：步骤S2中，去除脐带上皮组织过程中将消化处理后的脐带浸泡在无菌PBS中，用无菌细胞刮片刮除华通胶表面覆盖的一...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨致亭，程永智，马金环，胡学亭，于刚，潘德芹，
申请(专利权)人：潍坊市康华生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37