一种无血清成分的高效间充质干细胞培养液制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及一种间充质干细胞培养液。本发明专利技术中的间充质干细胞培养液，包括以下成分：人血小板裂解液、青链霉素（Pen Strep）、长效谷氨酰胺、趋化因子XCL1、趋化因子CCL3、热休克蛋白(HSP70)、端粒酶抑制剂IFN‑α 2b、基础培养基DMEM。该干细胞培养液成分来源广泛，培养的间充质干细胞纯度高，增殖快，干性好，适合进行体外大规模培养以进行临床前研究和相关临床研究。

【技术实现步骤摘要】
一种无血清成分的高效间充质干细胞培养液
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种间充质干细胞培养液。
技术介绍
间充质干细胞（Mesenchymalstemcells）是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，源于发育早期的中胚层，主要存在于结缔组织和器官间质中，可以从骨髓、外周血、脂肪及皮肤等多种组织中获得。间充质干细胞属于非终末分化细胞，它既有间质细胞的特征，又有内皮细胞及上皮细胞的特征；作为一类多能干细胞，它在体外特定的诱导条件下，可以向骨、软骨、肌肉等方向增殖分化。目前研究表明间充质干细胞对系统性红斑狼疮、帕金森病、脊髓损伤等都有一定治疗效果。近年来，对间充质干细胞的研究日益增多，研究成果也在逐步走向临床应用，其中间充质干细胞的体外扩增培养是临床研究及应用的前提。但是在通常条件下，间充质干细胞在长期培养中易发生老化和凋亡，这些问题限制了间充质干细胞的进一步发展，寻找适合间充质干细胞的体外大规模培养体系，成为深入研究和应用间充质干细胞的热点之一。目前间充质干细胞的体外培养扩增体系主要是在基础培养基中添加一定浓度的胎牛血清或者生长因子，如专利20121021322.X中加入了B27和bFGF和EGF。这些生长因子的加入，可能导致体外扩增培养细胞的意外分化，使间充质干细胞失去干性。
技术实现思路
为弥补现有技术的不足，本专利技术提供一种无血清成分的高效间充质干细胞培养液，该干细胞培养液成分来源广泛，培养的间充质干细胞纯度高，增殖快，干性好，适合进行体外大规模培养以进行临床前研究和相关临床研究。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案。一种无血清成分的高效间充质干细胞培养液，包括以下成分：10%人血小板裂解液、0.4%青链霉素（PenStrep）、2mmol/L长效谷氨酰胺、15ng/ml趋化因子XCL1、25ng/ml趋化因子CCL3、18ng/ml热休克蛋白(HSP70)、26ng/ml端粒酶抑制剂IFN-α2b、基础培养基为DMEM。所述的无血清成分的高效间充质干细胞培养液pH值为6.8~7.0，渗透压为310mOsm/kg。所述的无血清成分的高效间充质干细胞培养液的制备方法，包括以下步骤。1.人血小板裂解液的制备。（1）取2×1011L-1的机采人血小板，加入250ml离心瓶中，6000g室温离心20min。（2）去上清，加入生理盐水洗血小板，2000g室温离心10min后用15ml生理盐水悬起。（3）置于-20℃冰箱中冷冻过夜，后置于室温下融化。（4）如此进行三个循环，得血小板裂解液。2.间充质干细胞培养液的制备。分别取100ml人血小板裂解液、4mlPenStrep（青链霉素）、2mmol长效谷氨酰胺、15ng/ml趋化因子XCL1、25ng/ml趋化因子CCL3、18ng/ml热休克蛋白（HSP70），26ng/ml端粒酶抑制剂IFN-α2b混合，然后用基础培养基DMEM补至1L体积，调节pH值为6.8~7.0，渗透压为310mOsm/kg，即得本专利技术间充质干细胞培养液。与现有技术相比，本专利技术的显著效果。1）本专利技术中的间充质干细胞培养液，其中人血小板裂解液含有多种生长因子，能够显著促进间充质干细胞生长，而且不会引入异种蛋白，确保临床应用的可行性。利用人血小板裂解液代替传统培养中的胎牛血清，保证间充质干细胞生长所需营养的同时，人血小板裂解液中的VEGF（血管内皮细胞生长因子），bFGF（碱性成纤维细胞生长因子），PDGF-AB（人血小板衍生生长因子AB），IGF-1（胰岛素样生长因子1），TGF-β1（转化生长因子β1）等因子会对间充质干细胞的生长起到促进作用。2）趋化因子XCL1和CCL3在体外促进间充质干细胞贴壁、同时促进间充质干细胞的体外扩增，热休克蛋白HSP70促进间充质干细胞结构蛋白的正确折叠，端粒酶抑制剂可以防止体外扩增中间充质干细胞的老化，这几种成分的组合是理想的间充质干细胞培养体系，对间充质干细胞的生长起到极大的促进作用。3）加入趋化因子XCL1和CCL3、热休克蛋白、端粒酶抑制剂，在体外间充质干细胞培养过程中能够刺激间充质干细胞生长的同时保证间充质干细胞的纯度和干性。附图说明图1为间充质干细胞贴壁生长状态图。图2为间充质干细胞增殖情况对比图。图3为间充质干细胞诱导为成脂细胞的油红O染色图。图4为间充质干细胞诱导为骨细胞的茜素红染色图。具体实施方式下面结合附图和实施例详细描述本专利技术，以下所述仅是本专利技术的优选实施方式，应当指出，对于本
的普通技术人员，在不脱离本专利技术方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本专利技术的保护范围。实施例。一、间充质干细胞培养液的制备。1.人血小板裂解液的制备。（1）取2×1011L-1的机采人血小板，加入250ml离心瓶中，6000g室温离心20min。（2）去上清，加入生理盐水洗血小板，2000g室温离心10min后用15ml生理盐水悬起。（3）置于-20℃冰箱中冷冻过夜，后置于室温下融化。（4）如此进行三个循环，得血小板裂解液。2.间充质干细胞培养液的制备。分别取100ml人血小板裂解液、4mlPenStrep（青链霉素）（Gibco，货号15140-122）、2mmol长效谷氨酰胺（Gibco，货号35050061）、15ng/ml趋化因子XCL1（Peprotech，货号：300-20）、25ng/ml趋化因子CCL3（Peprotech，货号：250-09）、18ng/ml热休克蛋白（HSP70）（上海信裕生物，货号：xy12Hu01），26ng/ml端粒酶抑制剂IFN-α2b（先灵葆雅公司，注册证号：s20120062）混合，然后用基础培养基DMEM补至1L体积，调节pH值为6.8~7.0，渗透压为310mOsm/kg，得本专利技术间充质干细胞培养液。二、脐带间充质干细胞的制备。步骤1、脐带的采集及运输。经产妇知情同意，采集足月健康胎儿新鲜无菌脐带组织，4℃保存，24小时内处理。脐带采集前后七天内采集母体血进行HIV检测、乙肝检测、丙肝检测、梅毒检测、谷丙转氨酶检测，全部检测合格后方可使用。清洁和消毒：在生物安全柜内取出脐带，先用0.9%的氯化钠注射液进行表面清洗，之后将脐带浸泡在75%酒精内，不超过2min，酒精经0.22微米的过滤器进行除菌；最后用0.9%的氯化钠注射液再次清洗，去除残余酒精和血渍。步骤2、将脐带剪成2-3cm的小段后，分别剔除外侧羊膜和内部血管得到华通氏胶；利用医用组织剪将华通氏胶剪成2mm3的组织小块；用0.9%的氯化钠注射液清洗2次，得到无血渍的华通氏胶组织小块（离心力300g，离心5min）。步骤3、取上述组织块放置在直径10cm的培养皿上，以恰好铺满培养皿底部且组织小块分布均匀为佳，此时可用无菌镊子移动组织小块位置，使其均匀分布；在生物安全柜内自然晾干2min，组织小块被固定在培养皿底部。步骤4、向上述培养皿内缓慢加入10mL间充质干细胞无血清培养体系，放置在CO2培养箱内37℃、5.0%CO2浓度下培养24h后进行一次全量换液，去除培养皿内的细胞碎片；在4-5天可观察到细胞从组织小块内爬出，在培养至第8天时进行二次全量换液，以补充营养物质。步骤5、细胞融合率达到70%以上时，使用细胞消化液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 一种无血清成分的高效间充质干细胞培养液，其特征在于，培养液包括以下成分：10%人血小板裂解液、0.4%青链霉素（Pen Strep）、2mmol/L长效谷氨酰胺、15ng/ml趋化因子XCL1、25ng/ml趋化因子CCL3、18ng/ml热休克蛋白(HSP70)、26ng/ml端粒酶抑制剂 IFN‑α 2b、基础培养基DMEM。

【技术特征摘要】
1.一种无血清成分的高效间充质干细胞培养液，其特征在于，培养液包括以下成分：10%人血小板裂解液、0.4%青链霉素（PenStrep）、2mmol/L长效谷氨酰胺、15ng/ml趋化因子XCL1、25ng/ml趋化因子CCL3、18ng/ml热休克蛋白(HSP70)、26ng/ml端粒酶抑制剂IFN-α2b、基础培养基DMEM。2.根据权利要求1所述的无血清成分的高效间充质干细胞培养液，其特征在于，培养液的pH值为6.8~7.0，渗透压为310mOsm/kg。3.一种无血清成分的高效间充质干细胞培养液的制备方法，包括以下步骤：步骤1、人血小板裂解液的制备：（1）取2×1011L-1的机采人血小板，加入250ml离...

【专利技术属性】
技术研发人员：李剑平，李晓丰，
申请(专利权)人：沈阳中心血站，
类型：发明
国别省市：辽宁,21