一种人脐带间充质干细胞大规模培养无血清培养基制造技术

本发明专利技术公开了一种人脐带间充质干细胞大规模培养无血清培养基，主要成分包括氨基酸，无机盐成分，生长因子及白蛋白成分。本发明专利技术的人脐带间充质干细胞大规模培养无血清培养基，不含任何血清组分，且成分明确，克服了异种蛋白污染和致病微生物的危险,解决了MSCs临床应用的生物安全性问题。采用本发明专利技术的无血清培养基可体外大规模培养人脐带间充质干细胞，可获得高数量、高纯度并且安全优质的脐带间充质干细胞，同时可提高细胞存活率，维持干细胞的特性。本发明专利技术可解决细胞数量不够的问题，且每批次的细胞数量、存活率及免疫表型更加稳定，符合相关指标要求。

A serum-free medium for large-scale culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells

The invention discloses a serum-free medium for large-scale culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells. The main components include amino acids, inorganic salts, growth factors and albumin components. The human umbilical cord mesenchymal stem cells of the present invention are cultured in a serum-free medium on a large scale without any serum components, and the components are clear, which overcomes the danger of contamination of xenogeneic proteins and pathogenic microorganisms, and solves the biological safety problem of clinical application of MSCs. The serum-free medium can be used to culture human umbilical cord mesenchymal stem cells on a large scale in vitro, and can obtain high-quantity, high-purity, safe and high-quality umbilical cord mesenchymal stem cells, at the same time, the cell survival rate can be improved and the characteristics of stem cells can be maintained. The invention can solve the problem that the number of cells is not enough, and the number, survival rate and immune phenotype of cells in each batch are more stable, which meets the requirements of relevant indicators.

【技术实现步骤摘要】
一种人脐带间充质干细胞大规模培养无血清培养基
本专利技术涉及一种人脐带间充质干细胞大规模培养的无血清培养基，属于细胞工程

技术介绍
间质干细胞（mesenchymalstemcells，MSCs）来源于中胚层，也称多能间充质基质细胞（multipotentmesenchymalstromalcells），为多能干细胞的一种，它最早发现于骨髓中，具有向三种胚层细胞分化的多向分化潜能，具有低免疫原性、不刺激产生同种异体免疫反应、不被细胞毒性T细胞和NK细胞杀伤，以及免疫调节作用。MSCs在相应的诱导条件下能分化为骨、脂肪、软骨、肌肉和肝细胞等不同类型细胞。脐带间充质干细胞是一类存在于人脐带中，具有多向分化潜能和自我更新能力的细胞群。它取材方便，来源广泛，其使用属“废物利用”，不受伦理、道德限制，可以为实验和临床提供充足的细胞来源，特别能为神经系统疾病的治疗带来新的希望。已经证明其能被诱导分化为成骨细胞、胰岛分泌细胞和类肝细胞等,并在免疫抑制治疗方面具有积极的临床应用前景，然而其临床应用必须以在体外获得高数量和高纯度的脐带间充质干细胞为基础。细胞培养基是决定细胞体外生长代谢最重要、最直接的环境因素。目前大多数合成细胞培养基均需要补充动物血清才能支持细胞的体外生长、增殖，而动物血清的使用带来了动物性病原微生物污染培养物的可能，因此推动了动物细胞无血清培养基的发展。同时，我国对血制品管理严格，成人AB血清不易获得且价格昂贵。动物血清如胎牛血清，对人类而言，存在异种蛋白抗原和携带在人类致病的未知病毒等危险，从而限制了脐带MSCs在临床的应用。细胞的微载体培养（microcarrierculture）是一种用于高产量培养贴壁细胞的实用技术，其培养体积从数毫升到6000升以上。应用微载体培养技术，在普通细胞悬浮培养系统中，每毫升培养液可培养数百万细胞。根据系统的设计，培养液通常含有1-5克/升微载体，接种5×104－2×105细胞/毫升，按20－60rpm速度搅拌。灌注微载体培养液（Perfusedmicrocarriercultures）可含高达20g/升。在首次进行悬浮微载体培养时，可参考以下介绍的一种方法。培养液的体积和接种量的大小应根据培养量的不同做相应的调整。配制100毫升的培养液，应将0.3克的微载体溶于30ml培养基中，加入到旋转式容器。再接种107细胞于该培养液中，轻轻混匀，37℃孵育。一旦细胞牢固地粘附在微载体的表面，即开始连续搅动。细胞粘附所需要的时间主要取决于该类细胞的粘附效率（attachmentefficiency）。如果细胞粘附的时间过长，需要间断性（每30分钟搅动2分钟）搅动培养液以保证细胞和微载体的均匀分布。然后，将培养液的容积增加到50毫升。搅拌的速度取决于培养容器，而且要足够快以防止微载体沉淀。1至2天后，培养液体积增加至100毫升，3至5天后，部分培养基需要更换,7天左右收获细胞。现有技术中，尚未见到有关于人脐带间充质干细胞大规模培养用的无血清培养基的报道。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术提供了一种人脐带间充质干细胞大规模培养用的无血清培养基，其不含动物源成分，可以完全实现无血清培养干细胞。采用本专利技术的无血清培养基培养人脐带间充质干细胞，可在体外获得高数量、高纯度并且安全优质的脐带间充质干细胞，同时可提高细胞存活率，维持干细胞的特性。本专利技术可解决细胞数量不够的问题，且每批次的细胞数量、存活率及免疫表型更加稳定。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种人脐带间充质干细胞大规模培养无血清培养基，是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位若无特别说明，均为mg/L：L-精氨酸100～300；CuSO4·5H2O0.0005～0.005；L-天门冬酰胺25～75；L-天门冬氨酸10～30；L-谷氨酸10～30；Ni（NO3）2·6H2O0.00002～0.0002；L-谷氨酰胺0～500；ZnSO4·7H2O0.06～0.6；甘氨酸5～15；CoCl2·6H2O0.001～0.008；L-组氨酸10～30；NaSiO3·9H2O0.001～0.01；L-异亮氨酸25～75；Na3VO4·12H2O0.0005～0.005；L-赖氨酸盐酸20～60；SnCl2·2H2O0.00001～0.0001；L-蛋氨酸10～30；Na2SeO30.002～0.01；L-苯丙氨酸10～30；FeSO4·7H2O0.2～1.6；L-脯氨酸10～30；葡萄糖1000～4000；L-丝氨酸15～45；维生素C0.176～0.704；L-苏氨酸10～30；对羟基苯甲酸0.5～1.5；L-色氨酸5～15；丙酮酸钠55～550；L-缬氨酸10～30；亚油酸0.01～0.05；L-亮氨酸25～75；β-巯基乙醇0.8～4.0；二水L-酪氨酸二钠144～432；乙醇胺1～5；L-胱氨酸二盐酸25～75；地塞米松0.001～0.005；人转铁蛋白5～50；人血清白蛋白1000～5000；纤粘连蛋白0.5～5；重组人成纤维细胞生长因子0.1～10；重组人转化因子β0.1～10；重组人表皮生长因子0.1～10；胰岛素：8～20；胆固醇：20～60；过氧化氢酶：20～50；亚硒酸钠：17.3～35.0；1％（质量百分数）二巯基乙醇溶液：0.35～1.0ml/L；余量为水。所述重组人成纤维细胞生长因子、重组人转化因子、重组人表皮生长因子均可市场购买得到，本专利技术所用为进口产品，均购自peprotech，商品名称为：EGF(重组人表皮生长因子)，商品号为AF-100-15-50；商品名称为TGF-b（重组人转化因子），货号：100-21-100；商品名为（FGF）成纤维细胞生长因子，商品货号：100-18B-50。本专利技术的无血清培养基的制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节pH值至7.1～7.4，即得，工业滤芯过滤，同时氮气保护进行分装（避免不稳定性成分被氧化）。本专利技术的人脐带间充质干细胞大规模培养用无血清培养基，不含任何血清组分，且成分明确，克服了异种蛋白污染和致病微生物的危险,解决了MSCs临床应用的生物安全性问题。采用本专利技术的无血清培养基可用于大规模培养人脐带间充质干细胞，可在体外获得高数量、高纯度并且安全优质的脐带间充质干细胞，同时可提高细胞存活率，维持干细胞的特性。本专利技术可解决细胞数量不够的问题，且每批次的细胞数量、存活率及免疫表型更加稳定，符合相关指标要求。附图说明图1：微载体培养装置。图2：微载体培养细胞显微照片100×。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明。下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。实施例1制备人脐带间充质干细胞大规模培养无血清培养基各原料的浓度如下，各浓度单位若无特别说明，均为mg/L：L-精氨酸200；CuSO4·5H2O0.002；L-天门冬酰胺50；L-天门冬氨酸20；L-谷氨酸20；Ni（NO3）2·6H2O0.0001本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人脐带间充质干细胞大规模培养无血清培养基，其特征在于：是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位若无特别说明，均为mg/L：L‑精氨酸 100～300；CuSO4·5H2O 0.0005～0.005；L‑天门冬酰胺25～75；L‑天门冬氨酸10～30；L‑谷氨酸 10～30；Ni（NO3）2·6H2O 0.00002～0.0002；L‑谷氨酰胺0～500；ZnSO4·7H2O 0.06～0.6；甘氨酸 5～15；CoCl2·6H2O 0.001～0.008；L‑组氨酸10～30；NaSiO3·9H2O 0.001～0.01；L‑异亮氨酸 25～75；Na3VO4·12H2O 0.0005～0.005；L‑赖氨酸盐酸20～60；SnCl2·2H2O 0.00001～0.0001；L‑蛋氨酸10～30；Na2SeO3 0.002～0.01；L‑苯丙氨酸10～30；FeSO4·7H2O 0.2～1.6；L‑脯氨酸10～30；葡萄糖 1000～4000；L‑丝氨酸15～45；维生素C 0.176～0.704；L‑苏氨酸10～30；对羟基苯甲酸0.5～1.5；L‑色氨酸5～15；丙酮酸钠 55～550；L‑缬氨酸10～30；亚油酸 0.01～0.05；L‑亮氨酸 25～75；β‑巯基乙醇 0.8～4.0；二水L‑酪氨酸二钠144～432；乙醇胺 1～5；L‑胱氨酸二盐酸25～75；地塞米松 0.001～0.005；人转铁蛋白 5～50；人血清白蛋白 1000～5000；纤粘连蛋白 0.5～5；重组人成纤维细胞生长因子 0.1～10；重组人转化因子β 0.1～10；重组人表皮生长因子0.1～10；胰岛素：8～20；胆固醇：20～60；过氧化氢酶：20～50；亚硒酸钠：17.3～35.0；1％二巯基乙醇溶液：0.35～1.0ml/L；余量为水。...

【技术特征摘要】
1.一种人脐带间充质干细胞大规模培养无血清培养基，其特征在于：是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位若无特别说明，均为mg/L：L-精氨酸100～300；CuSO4·5H2O0.0005～0.005；L-天门冬酰胺25～75；L-天门冬氨酸10～30；L-谷氨酸10～30；Ni（NO3）2·6H2O0.00002～0.0002；L-谷氨酰胺0～500；ZnSO4·7H2O0.06～0.6；甘氨酸5～15；CoCl2·6H2O0.001～0.008；L-组氨酸10～30；NaSiO3·9H2O0.001～0.01；L-异亮氨酸25～75；Na3VO4·12H2O0.0005～0.005；L-赖氨酸盐酸20～60；SnCl2·2H2O0.00001～0.0001；L-蛋氨酸10～30；Na2SeO30.002～0.01；L-苯丙氨酸10～30；FeSO4·7H2O0.2～1.6；L-脯氨酸10～30；葡萄糖1000～4000；L-丝氨酸15～45；维生素C0.176～0.704；L-苏氨酸10～30；对羟基苯甲酸0.5～1.5；L-色氨酸5～15；丙酮酸钠55～550；L-缬氨酸10～30；亚油酸0.01～0.05；L-亮氨酸25～75；β-巯基乙醇0.8～4.0；二水L-酪氨酸二钠144～432；乙醇胺1～5；L-胱氨酸二盐酸25～75；地塞米松0.001～0.005；人转铁蛋白5～50；人血清白蛋白1000～5000；纤粘连蛋白0.5～5；重组人成纤维细胞生长因子0.1～10；重组人转化因子β0.1～10；重组人表皮生长因子0.1～10；胰岛素：8～20；胆固醇：20～60；过氧化氢酶：20～50；亚硒酸钠：17.3～35.0；1％二巯基乙醇溶液：0.35～1.0ml/L；余量为水。2.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞大规模培养无血清培养基，其特征在于：是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位为mg/L：L-精氨酸200；CuSO4·5H2O0.002；L-天门冬酰胺50；L-天门冬氨酸20；L-谷氨酸20；Ni（NO3）2·6H2O0.0001；L-谷氨酰胺300；ZnSO4·7H2O0.3；甘氨酸10；CoCl2·6H2O0.005；L-组氨酸20；NaSiO3·9H2O0.005；L-异亮氨酸50；Na3VO4·12H2O0.002；L-赖氨酸盐酸40；SnCl2·2H2O0.00005；L-蛋氨酸20；...

【专利技术属性】
技术研发人员：张昕，
申请(专利权)人：王晓柯，
类型：发明
国别省市：北京,11