一种用于活化干细胞的方法和装置制造方法及图纸

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种用于活化干细胞的方法和装置，取健康BALB/cl和C57BL/6小鼠，雌雄不限，6～8周龄；小鼠脾脏干细胞的培养和分化：小鼠脾脏干细胞的培养条件；培养皿用gelatin 0.1％包被,加小鼠脾脏成纤维细胞为滋养层,克隆形成能力和胚样小体形成能力检测；Sp‑MSCs的分离培养；分化能力鉴定；小鼠T淋巴细胞分离；细胞因子处理,抗体阵列以及Westernblot；淋巴细胞转化实验和混合淋巴细胞反应：统计学。本发明专利技术提出了通过分析细胞信号传导网络来表征细胞状态的一个新概念。通过同时检测细胞内的多个信号网络节点,就能够揭示细胞内各种激酶的活力动态。

A Method and Device for Activating Stem Cells

The invention belongs to the field of biotechnology, and discloses a method and device for activating stem cells. Healthy BALB/cl and C57BL/6 mice, male and female, 6-8 weeks old, culture and differentiation of mouse spleen stem cells: culture conditions of mouse spleen stem cells, culture dish coated with gelatin 0.1%, mouse spleen fibroblasts as trophoblast, cloning ability and embryoid corpuscles are obtained. Formation ability test; Sp MSCs isolation and culture; differentiation ability identification; mouse T lymphocyte isolation; cytokine treatment, antibody array and Western blot; lymphocyte transformation test and mixed lymphocyte reaction: statistics. The present invention proposes a new concept to characterize cell state by analyzing cell signal transduction network. By simultaneously detecting multiple signal network nodes in cells, we can reveal the dynamic activity of various kinases in cells.

【技术实现步骤摘要】
一种用于活化干细胞的方法和装置
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种用于活化干细胞的方法和装置。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：细胞治疗在临床上被寄予极大希望。为得到大量所需的细胞类型,从脾脏干细胞分化就成为最可能的选择之一。这里很重要的一个问题就是质量控制,因为不同的专利技术室的培养条件及对细胞的处理方法有差别。不同专利技术组的起始及终端细胞间有多相似？这个细胞确认问题在体外分化专利技术中尤其重要,因为这时细胞以不均一的混合形式,经历一系列的发育过程,并多次改变其分化状态。尽管一些分子标记的表达可以用来表征分化状态,但是绝大部分的分子标记在发育过程中其特异性都是相对的。细胞分化命运的确定,是发育生物学中的一个关键问题,其中包括复杂的组织相互作用和多个信号传导途径的整合。细胞通常都有一个分化系的历史,然后逐渐成为进一步分化的细胞类型。在另一方面,细胞的分化状态又常常被认为是由转录因子的特异组合而确定。这一观念被最近iPSC的成功诱导而得到强化:通过转入少数几个因子,成体动物的成纤维细胞和其他终端分化细胞都可以被重编程为类似于脾脏干细胞的iPSC。然而,这个观点可能过于简化了,因为其中关于细胞分化的历史以及相关的信号传导事件都被忽略了。间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是一种最早在骨髓中发现的非造血谱系的干细胞，随后亦在骨、脐带和脂肪等组织中有发现。MSCs不仅具有干细胞的共性，同时也具有自身的特性。MSCs像大多数干细胞一样，具有多向分化和自我更新能力。更重要的是，MSCs是目前已知的多种干细胞中，较为确定地具有免疫调节能力的一类干细胞。相关研究表明，MSCs可以调节多种免疫细胞如巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、树突状细胞和中性粒细胞等发育分化和凋亡，有助于维持机体免疫反应和免疫稳态。此外，MSCs还调节多种免疫细胞的功能，避免过度的机体免疫应答。目前的研究结果表明，MSCs主要通过表达细胞间粘附分子(如细胞间粘附分子1和内皮细胞粘附分子1)、释放一些重要的细胞因子和活性物质以及释放膜微粒等形式来发挥免疫调控作用。脾脏是人和动物体内最大的外周免疫器官。脾脏内含有多种免疫细胞如巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、树突状细胞和中性粒细胞等，是免疫细胞发育和成熟的重要器官之一，更是机体的体液免疫中心和细胞免疫。脾脏内免疫细胞的发育功能要受到脾脏微环境的调控。多种基质细胞混合组成的脾脏基质组织既为免疫细胞发育提供了空间依托，又表达多种活性分子调节免疫细胞功能，是脾脏微环境的重要组成部分。因此，脾脏基质组织内细胞对于免疫细胞发育和功能的调控一直是免疫学研究的热点之一。但是，以往的研究多关注于脾脏内皮源性基质细胞和成纤维细胞等成体细胞的作用，对于处于发育源头的脾脏间充质干细胞(spleenmesenchymalstemcells，Sp-MSCs)是否参与免疫调控，国内外文献报道不多。综上所述，现有技术存在的问题是：揭示细胞内各元件组织方式的一个方法是,通过外加刺激来探讨细胞的反应方式。细胞信号传导网络对刺激因子的特征性反应已经被应用于探讨肿瘤细胞状态的不均一性。进一步专利技术表明,细胞对外加刺激的处理方式是通用的,而表现型的差别主要在于上游信号网络的激活方式有不同。因此,细胞的特征有可能通过分析其信号传导网络来揭示。现有技术没有利用建立的胶原酶消化联合组织块培养法，分离获得大量细胞纯净度较高的小鼠Sp-MSCs。没有在的细胞模型基础之上，着重关注Sp-MSCs对非特异抗原和同种异体抗原活化的T淋巴细胞增殖和活化的影响。本专利技术用一个小鼠干细胞体外分化的模型来探讨细胞确认的问题。现有的数据分析装置，分析数据准确性差。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种用于活化干细胞的方法和装置。本专利技术是这样实现的，一种用于活化干细胞的方法，所述用于活化干细胞的方法包括：1)取健康BALB/cl和C57BL/6小鼠，雌雄不限，6～8周龄；2)小鼠脾脏干细胞的培养和分化：小鼠脾脏干细胞的培养条件:培养皿用gelatin0.1％包被,加小鼠脾脏成纤维细胞为滋养层,1000U/mLLIF,15％胎牛血清,0.1mmol/L非必需氨基酸,2mmol/L谷氨酰胺,0.1mmol/Lβ-巯基乙醇,knock-outDulbecco’smodifiedEagle’smedium；3)克隆形成能力和胚样小体形成能力检测:1000个细胞在六孔板的孔内培养5～6天,培养条件同小鼠脾脏干细胞的培养,但是不加脾脏成纤维细胞；细胞用4％PFA固定后,用NBT/BCIP染色碱性磷酸酶,计数阳性克隆的数量；胚样小体的检测中，1000个细胞培养在半固体培养基methylcellulose-basedsemi-solidmedium中,5～6天后计数胚样小体；重复3次；4)Sp-MSCs的分离培养：无菌条件下以注射器柄将脾脏碾碎，以0.1％的II型胶原酶液消化获得的基质组织1h，将消化后的基质组织种入Sp-MSCs培养体系内，3d首次换液；待Sp-MSCs爬满培养瓶后，以胰酶消化传代，取第3～6代细胞；5)Sp-MSCs的分化能力鉴定：取第4代Sp-MSCs，种于24孔培养板中，加入成骨诱导体系:含有10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，地塞米松10－7mol/L，β磷酸甘油10mmol/L和维生素C磷酸盐50μmol/L；诱导7d进行碱性磷酸酶染色；取第4代Sp-MSCs，种于3×104/cm2的24孔培养板中，加入成脂肪诱导体系:含有10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，IBMX0.5μmol/L，地塞米松10－6mol/L和胰岛素10ng/mL；诱导7d后进行油红染色；6)小鼠T淋巴细胞分离：无菌条件下以注射器柄碾磨鼠脾脏，将获得的粗制细胞悬液过200目钢筛去除团块，再以Ficoll分离液以800g离心20min，得到混合的脾脏免疫细胞；以PBS洗净，将脾脏免疫细胞过填充有尼龙毛的50mL注射器，收获的不贴附的细胞即为T淋巴细胞；7)流式细胞分析FACS：Oct4-GFP细胞经消化,成单细胞悬液在PBS中,用FACSScan通过cellquestsoftware分析；通过正面和侧面的光散射特征确认活细胞,LW系为阴性对照,读取GFP的荧光强度；8)、细胞因子处理,抗体阵列以及Westernblot；9)、淋巴细胞转化实验和混合淋巴细胞反应：进行分析的T淋巴细胞需预先进行CFSE标记；T淋巴细胞的密度调整为1×106ml，加入ConA2μg/mL，48h后拍照；10)、统计学方法：结果以数据分析装置集成的软件分析，数据以均值方差表示，P值小于0.05为统计学意义，P＜0.05，P＜0.01。进一步，步骤2)中，小鼠脾脏干细胞分化中，mESC预先在无脾脏成纤维细胞条件下传代两次以去除脾脏成纤维细胞细胞；培养中极少的脾脏成纤维细胞,mESC为克隆生长,有清晰边缘；在40％～50％密度时进行去LIF分化或者外加因子刺激。进一步，步骤8)中，细胞因子处理包括：LIF刺激,细胞预先在无LIF的培养液中维持2h以达到一个基础水平；2000U/mLLIF加入后,细胞在0min,15min和1h时间点分别收获,裂解；FGF8本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于活化干细胞的方法，其特征在于，所述用于活化干细胞的方法包括：1)取健康BALB/cl和C57BL/6小鼠，雌雄不限，6～8周龄；2)小鼠脾脏干细胞的培养和分化：小鼠脾脏干细胞的培养条件:培养皿用gelatin0.1％包被,加小鼠脾脏成纤维细胞为滋养层,1000U/mLLIF,15％胎牛血清,0.1mmol/L非必需氨基酸,2mmol/L谷氨酰胺,0.1mmol/Lβ‑巯基乙醇,knock‑outDulbecco’smodifiedEagle’smedium；3)克隆形成能力和胚样小体形成能力检测:1000个细胞在六孔板的孔内培养5～6天,培养条件同小鼠脾脏干细胞的培养,但是不加脾脏成纤维细胞；细胞用4％PFA固定后,用NBT/BCIP染色碱性磷酸酶,计数阳性克隆的数量；胚样小体的检测中，1000个细胞培养在半固体培养基methylcellulose‑basedsemi‑solidmedium中,5～6天后计数胚样小体；重复3次；4)Sp‑MSCs的分离培养：无菌条件下以注射器柄将脾脏碾碎，以0.1％的II型胶原酶液消化获得的基质组织1h，将消化后的基质组织种入Sp‑MSCs培养体系内，3d首次换液；待Sp‑MSCs爬满培养瓶后，以胰酶消化传代，取第3～6代细胞；5)Sp‑MSCs的分化能力鉴定：取第4代Sp‑MSCs，种于24孔培养板中，加入成骨诱导体系:含有10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，地塞米松10－7mol/L，β磷酸甘油10mmol/L和维生素C磷酸盐50μmol/L；诱导7d进行碱性磷酸酶染色；取第4代Sp‑MSCs，种于3×104/cm2的24孔培养板中，加入成脂肪诱导体系:含有10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，IBMX0.5μmol/L，地塞米松10－6mol/L和胰岛素10ng/mL；诱导7d后进行油红染色；6)小鼠T淋巴细胞分离：无菌条件下以注射器柄碾磨鼠脾脏，将获得的粗制细胞悬液过200目钢筛去除团块，再以Ficoll分离液以800g离心20min，得到混合的脾脏免疫细胞；以PBS洗净，将脾脏免疫细胞过填充有尼龙毛的50mL注射器，收获的不贴附的细胞即为T淋巴细胞；7)流式细胞分析FACS：Oct4‑GFP细胞经消化,成单细胞悬液在PBS中,用FACSScan通过cellquestsoftware分析；通过正面和侧面的光散射特征确认活细胞,LW系为阴性对照,读取GFP的荧光强度；8)、细胞因子处理,抗体阵列以及Westernblot；9)、淋巴细胞转化实验和混合淋巴细胞反应：进行分析的T淋巴细胞需预先进行CFSE标记；T淋巴细胞的密度调整为1×106ml，加入ConA 2μg/mL，48h后拍照；10)、统计学方法：结果以数据分析装置集成的软件分析，数据以均值方差表示，P值小于0.05为统计学意义，P＜0.05，P＜0.01。...

【技术特征摘要】
1.一种用于活化干细胞的方法，其特征在于，所述用于活化干细胞的方法包括：1)取健康BALB/cl和C57BL/6小鼠，雌雄不限，6～8周龄；2)小鼠脾脏干细胞的培养和分化：小鼠脾脏干细胞的培养条件:培养皿用gelatin0.1％包被,加小鼠脾脏成纤维细胞为滋养层,1000U/mLLIF,15％胎牛血清,0.1mmol/L非必需氨基酸,2mmol/L谷氨酰胺,0.1mmol/Lβ-巯基乙醇,knock-outDulbecco’smodifiedEagle’smedium；3)克隆形成能力和胚样小体形成能力检测:1000个细胞在六孔板的孔内培养5～6天,培养条件同小鼠脾脏干细胞的培养,但是不加脾脏成纤维细胞；细胞用4％PFA固定后,用NBT/BCIP染色碱性磷酸酶,计数阳性克隆的数量；胚样小体的检测中，1000个细胞培养在半固体培养基methylcellulose-basedsemi-solidmedium中,5～6天后计数胚样小体；重复3次；4)Sp-MSCs的分离培养：无菌条件下以注射器柄将脾脏碾碎，以0.1％的II型胶原酶液消化获得的基质组织1h，将消化后的基质组织种入Sp-MSCs培养体系内，3d首次换液；待Sp-MSCs爬满培养瓶后，以胰酶消化传代，取第3～6代细胞；5)Sp-MSCs的分化能力鉴定：取第4代Sp-MSCs，种于24孔培养板中，加入成骨诱导体系:含有10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，地塞米松10－7mol/L，β磷酸甘油10mmol/L和维生素C磷酸盐50μmol/L；诱导7d进行碱性磷酸酶染色；取第4代Sp-MSCs，种于3×104/cm2的24孔培养板中，加入成脂肪诱导体系:含有10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，IBMX0.5μmol/L，地塞米松10－6mol/L和胰岛素10ng/mL；诱导7d后进行油红染色；6)小鼠T淋巴细胞分离：无菌条件下以注射器柄碾磨鼠脾脏，将获得的粗制细胞悬液过200目钢筛去除团块，再以Ficoll分离液以800g离心20min，得到混合的脾脏免疫细胞；以PBS洗净，将脾脏免疫细胞过填充有尼龙毛的50mL注射器，收获的不贴附的细胞即为T淋巴细胞；7)流式细胞分析FACS：Oct4-GFP细胞经消化,成单细胞悬液在PBS中,用FACSScan通过cellquestsoftware分析；通过正面和侧面的光散射特征确认活细胞,LW系为阴性对照,读取GFP的荧光强度；8)、细胞因子处理,抗体阵列以及Westernblot；9)、淋巴细胞转化实验和混合淋巴细胞反应：进行分析的T淋巴细胞需预先进行CFSE标记；T淋巴细胞的密度调整为1×106ml，加入ConA2μg/mL，48h后拍照；10)、统计学方法：结果以数据分析装置集成的软件分析，数据以均值方差表示，P值小于0.05为统计学意义，P＜0.05，P＜0.01。2.如权利要求1所述的用于活化干细胞的方法，其特征在于，步骤2)中，小鼠脾脏干细胞分化中，mESC预先在无脾脏成纤维细胞条件下传代两次以去除脾脏成纤维细胞细胞；培养中极少的脾脏成纤维细胞,mESC为克隆生长,有清晰边缘；在40％～50％密度时进行去LIF分化或者外加因子刺激。3.如权利要求1所述的用于活化干细胞的方法，其特征在于，步骤8)中，细胞因子处理包括：LIF刺激,细胞预先在无LIF的培养液中维持2h以达到一个基础水平；2000U/mLLIF加入后,细胞在0min,15min和1h时间点分别收获,裂解；FGF8刺激,终浓度20ng/mL以及1μg/mL的肝素直接加入培养液中混合均匀；细胞裂解液直接用于R&DsystemsProteomeProfilerTMArray,humanphospho-MAPK抗体阵列分析,或者用Westernblot分析。4.如权利要求1所述的用于活化干细胞的方法，其特征在于，步骤8)中，对抗体阵列分析,1×107个细胞的裂解液被用于每一个抗体阵列膜的检测；4℃过夜孵育,生物素标记的、磷酸化特异的二抗孵育,最后用HRP-avidin及化学荧光法显影；每个斑点的强度通过ImageJ定量。5.如权利要求1所述的用于活化干细胞的方法，其特征在于，步骤8)中，Westernblot分析；15μg蛋白裂解液用10％SDS-PAGE分离,电转到PVDF膜上；所用一抗包括:Oct4(ChemiconAB3209),pERKThr202/Tyr204(CellSigna...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜玲娟，杨镛，杨国凯，马振桓，万嘉，李国剑，侯毅，
申请(专利权)人：杜玲娟，
类型：发明
国别省市：云南,53