一种PDGFRβ靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体，它是肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体与ZPDGFRβ的融合蛋白，ZPDGFRβ通过连接子连接在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的N末端或者C末端。本发明专利技术还公开了一种如核苷酸序列以及包括它的重组载体、重组菌，还公开了前述变异体的制备方法和用途。本发明专利技术的TRAIL变异体蛋白Z‑hTRAIL具有良好的肿瘤杀伤活性，并且对肝脏纤维化也有明确疗效，临床应用前景良好。

A PDGFRbeta Targeted Tumor Necrosis Factor Related Apoptosis Inducing Ligand Variant and Its Preparation and Application

The invention discloses a variant of TNF-related apoptotic inducing ligand, which is a fusion protein of TNF-related apoptotic inducing ligand and ZPDGFRbeta. ZPDGFRbeta is connected to the N or C terminal of TNF-related apoptotic inducing ligand through a connector. The invention also discloses a nucleotide sequence, a recombinant vector and a recombinant bacterium including the nucleotide sequence, and a preparation method and use of the said variant. The TRAIL variant protein Z hTRAIL of the invention has good tumor killing activity, definite curative effect on liver fibrosis, and good clinical application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种PDGFRβ靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体及其制备方法和用途
本专利技术涉及生物技术药物领域，具体涉及PDGFRβ靶向性肿瘤促凋亡诱导配体变异体及其制备方法和用途。
技术介绍
肿瘤坏死因子凋亡相关诱导配体(TRAIL)属于肿瘤坏死因子(TNF)家族成员，其C末端114-281位氨基酸可以被蛋白酶水解为可溶性的胞外段，形成同源三聚体，具有受体结合能力。TRAIL的膜受体包括死亡受体(DR4和DR5)和诱骗受体(DcR1和DcR2)。死亡受体DR4和DR5分子中含有死亡结构域，与TRAIL结合后能向胞内传递死亡信号，诱导细胞凋亡。相反，诱骗受体DcR1分子不含死亡结构域，DcR2的死亡结构域不完整，二者能与TRAIL结合，但不能传递死亡信号，因而不诱导细胞凋亡。肿瘤细胞和一些异常活化细胞均高表达死亡受体，TRAIL能促进这些细胞凋亡。正常细胞往往高表达诱骗受体而免于TRAIL的伤害。因此，TRAIL可能被发展为理想的治疗性药物。研究发现，肿瘤细胞表面高表达死亡受体，因而TRAIL体外条件下显示了超强的肿瘤细胞杀伤活性，被认为是潜在的抗肿瘤药物。但是，TRAIL的体内抗肿瘤效果与其体外对肿瘤细胞的杀伤活性不匹配。可能的原因包括：1)TRAIL分子量小，体内半衰期短。解决的办法包括利用聚乙二醇修饰或血清白蛋白融合/结合等方法延长半衰期。2)由于诱骗受体广泛表达于正常组织，TRAIL进入体内后被正常组织大量消耗，到达肿瘤部位量少，因而抗肿瘤效果不佳。改善的方法主要是利用导向分子递送TRAIL，使其富集于肿瘤部位，进而提高抗肿瘤效果。已有研究以肿瘤细胞或肿瘤新生血管内皮细胞为靶细胞进行TRAIL的递送。周细胞是重要的血管壁细胞，其分布于血管内皮细胞后侧，对血管的形成及稳定有重要的调控作用。但是，尚无利用周细胞作为靶细胞向瘤内提送TRAIL的研究。肝星状细胞活化是肝纤维化的始动环节。抑制或清除活化的肝星状细胞能延缓肝纤维化过程。研究发现，肝星状细胞活化过程中会高表达死亡受体DR4和DR5。因此，TRAIL能够诱导活化的肝星状细胞凋亡而显示抗纤维化作用。已有研究用PEG修饰的长效化TRAIL缓解了大鼠肝纤维化进程。但是，由于TRAIL对肝星状细胞缺乏靶向性，治疗效果不佳。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种PDGFRβ靶向性肿瘤促凋亡诱导配体变异体及其制备方法和用途。本专利技术肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体，它是肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体与ZPDGFRβ的融合蛋白，ZPDGFRβ通过连接子连接在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的N末端或者C末端。其中，所述ZPDGFRβ的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。优选地，所述ZPDGFRβ由SEQIDNO：2所示的核苷酸序列编码。其中，所述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示。优选地，所述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体由SEQIDNO：4所示的核苷酸序列编码。其中，所述连接子由2～20个氨基酸组成。其中，所述连接子是(G4S)3连接子，其氨基酸序列如SEQIDNO：5所示。优选地，所述连接子由SEQIDNO：6所示的核苷酸序列编码。其中，所述变异体的氨基酸序列如SEQIDNO：7所示。优选地，所述变异体由SEQIDNO：8所示的核苷酸序列编码。本专利技术还提供了一种核苷酸序列，它包括肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的编码序列与ZPDGFRβ的编码序列，二者之间通过连接子的编码序列连接。其中，所述ZPDGFRβ的编码序列如SEQIDNO：2所示。其中，所述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的编码序列如SEQIDNO：4所示。其中，所述连接子是(G4S)3连接子，其核苷酸序列如SEQIDNO：6所示。其中，其如SEQIDNO：8所示。本专利技术还提供了前述核苷酸序列的重组载体或重组菌。本专利技术还提供了一种制备前述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体的方法，其特征在于：它是以前述核苷酸序列为目标片段，采用基因工程的方法制备得到的。本专利技术还提供了前述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体在制备治疗细胞增生性疾病的药物中的用途。其中，所述治疗细胞增生性疾病的药物是治疗肿瘤或自身免疫性疾病的药物。所述肿瘤为结直肠腺癌。本专利技术还提供了一种抗肿瘤药物，它是以前述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。本专利技术还提供了前述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体在制备治疗器官纤维化疾病的药物中的用途。其中，所述药物是治疗肝脏纤维化的药物。本专利技术还提供了一种治疗肝脏纤维化的药物，它是以前述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。本专利技术利用能特异性识别PDGFRβ亲和体ZPDGFRβ为导向分子，将其与人源TRAIL(hTRAIL)融合，构建了融合蛋白Z-hTRAIL，并发现其体内外抗肿瘤和抗肝纤维化作用比hTRAIL明显增强，临床应用前景良好。根据本专利技术的上述内容，按照本专利技术相关领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。附图说明图1变异体Z-hTRAIL的分子设计；图2Z-hTRAIL和hTRAIL的SDS-PAGE电泳；图3Z-hTRAIL和hTRAIL凝胶过滤层析；图4Z-hTRAIL和hTRAIL与周细胞结合后对肿瘤细胞的杀伤；图5Z-hTRAIL和hTRAIL的肿瘤靶向性比较；A:瘤内富集的活体观察B:组织分布；图6Z-hTRAIL和hTRAIL对LS174T肿瘤的体内治疗效果；图7Z-hTRAIL和hTRAIL对COLO205肿瘤的体内治疗效果；图8Z-hTRAIL和hTRAIL对HCT116肿瘤的体内治疗效果；图9Z-hTRAIL和hTRAIL对肝星状细胞的结合(A)和杀伤(B)；图10Z-hTRAIL和hTRAIL治疗后小鼠肝功能指标；图11Z-hTRAIL和hTRAIL治疗后小鼠肝组织天狼星红染色；图12Z-hTRAIL和hTRAIL治疗后小鼠肝组织纤维化评分(A)和羟脯氨酸含量(B)；图13对照蛋白Zf-TRAIL和TRAIL的体外细胞杀伤(A)和体内抗肿瘤效果(B,C)比较。具体实施方式以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。实施例1Z-hTRAIL变异体的分子设计及克隆构建1、Z-hTRAIL变异体的分子设计ZPDGFRβ由58个氨基酸组成(表1)。hTRAIL为人TRAIL胞外段114-281的氨基酸组成的片段(见表1)。通过(G4S)3Linker将ZPDGFRβ连接在hTRAIL的N末端，构建融合蛋白ZPDGFRβ-(G4S)3-hTRAIL(简称Z-hTRAIL)(图1)。2、Z-TRAIL变异体表达载体的构建根据ZPDGFRβ的氨基酸序列，设计其初始编码基因，再经核酸分析软件优化后，由南京金斯瑞公司进行基因序列的合成。合成时在序列的两端分别添加EcoRI/BamHI限制性内切酶酶切位点(EcoRI:gaattc/BamHIggatcc)。通过双酶切和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体，其特征在于：它是肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体与ZPDGFRβ的融合蛋白，ZPDGFRβ通过连接子连接在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的N末端或者C末端。

【技术特征摘要】
2017.05.31 CN 20171039822651.一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体，其特征在于：它是肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体与ZPDGFRβ的融合蛋白，ZPDGFRβ通过连接子连接在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的N末端或者C末端。2.根据权利要求1所述的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体，其特征在于：所述ZPDGFRβ的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示；和/或，所述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示；和/或，所述连接子由2～20个氨基酸组成，优选所述连接子是(G4S)3连接子，其氨基酸序列如SEQIDNO：5所示。3.根据权利要求23所述的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体，其特征在于：所述ZPDGFRβ由SEQIDNO：2所示的核苷酸序列编码；和/或，所述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体由SEQIDNO：4所示的核苷酸序列编码；和/或，所述连接子由SEQIDNO：6所示的核苷酸序列编码。4.根据权利要求1～3任意一项所述的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNO：7所示。5.根据权利要求4所述的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体，其特征在于：其由SEQIDNO：8所示的核苷酸序列编码。6.一种核苷酸序列，其特征在于：它包括肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的编码序列与ZPDGFRβ的编码序列，二者之间通过连接子的编码序列连接。7.根据权利要求6所述的编码序列，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶泽，杨浩，卢晓风，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：四川,51