本发明专利技术涉及重组Martentoxin的制备及表征。具体地，本发明专利技术将Martentoxin基因与载体pETDuent‑1连接得到重组表达载体pETDuent‑1‑MarTX，将该重组表达载体转化至E.coli Origami B(DE3)，筛选得到高效表达菌株。通过诱导表达、亲和层析纯化及表征，获得了各方面理化性质均正确的多肽—重组MarTX毒素。经电生理实验测定发现，本发明专利技术提供的重组MarTX毒素具有生物活性，可显著抑制大电导钙离子和电压激活的钾离子(BK)通道电流。本发明专利技术实现了MarTX毒素的绿色制造，获得的MarTX毒素产量高、纯度高，并且具有较高的生理活性。
Preparation, Characterization and Application of Recombinant Martentoxin
The present invention relates to the preparation and characterization of recombinant Martentoxin. Specifically, the present invention connects Martentoxin gene with vector pETDuent_1 to obtain recombinant expression vector pETDuent_1_MarTX, transforms the recombinant expression vector into E.coli Origami B (DE3), and screens high-efficient expression strains. The recombinant MarTX toxin, a polypeptide with correct physical and chemical properties, was obtained by induction, affinity chromatography, purification and characterization. The recombinant MarTX toxin provided by the invention has biological activity and can significantly inhibit the current of large conductance calcium ion and voltage activated potassium ion (BK) channel. The invention realizes the green manufacturing of MarTX toxin, and the obtained MarTX toxin has high yield, high purity and high physiological activity.
【技术实现步骤摘要】
重组Martentoxin的制备、表征及应用
本专利技术涉及重组Martentoxin的制备、表征及应用，属于多肽毒素和生物技术工程领域。具体地，本专利技术涉及一种从东亚钳蝎(ButhusmartensiKarsch,BmK)毒液中分离纯化得到的毒素—Martentoxin的重组制备技术和理化性质的表征，以及该重组毒素在大电导钙离子和电压激活的钾离子(BK)通道中的应用。
技术介绍
研究表明，蛇、蜈蚣、蝎子、蜘蛛、海葵、锥螺等有毒生物的毒液中含有大量具有药理活性的多肽。目前有多种含分子内二硫键的毒液衍生物通过FDA批准，治疗高血压、疼痛及糖尿病[Venomstodrugs:venomasasourceforthedevelopmentofhumantherapeutics[M].City:RoyalSocietyofChemistry,2015]。更多毒素分子正处于临床研究中，它们靶向癫痫、癌症和自身免疫等疾病[Curr.Pharm.Des.2007,13,2927-2934；Toxins2010,2,2851-2871；ExpertOpi.Biol.Ther.2011,11,1469-1484]。东亚钳蝎(ButhusmartensiKarsch,BmK)的蝎毒中富含多种具有天然活性的多肽，其中大部分可作用于离子通道。迄今为止，该蝎毒通过分离纯化已获得14种短链钾离子通道阻断剂(BmTX1-3、BmKTX、BmP01-3、BmP05、BmP09、BmKK1-4和Martentoxin)[Biochemistry1997,36,13473-13482；J.Biol.Chem.2004,279,34562-34569；Eur.J.Biochem.1997,245,457-64]。这种Martentoxin(简称MarTX)由37个氨基酸构成，具有三对二硫键，是一种特异性作用于BK通道的短链多肽毒素[J.Neurochem.2003,84,325-335]，可显著抑制神经型(α+β4)BK通道电流。目前，人工获取多肽的方法主要有三种：重组表达法、内源提取法和化学合成法。其中，内源提取法是最古老也最直接的方法，但提取出的多肽种类有限，产量较低。应用最多的化学合成法为Fmoc(9-芴甲氧羰基)固相合成法。该方法涉及线性肽链的合成、碘氧化体系、半胱氨酸的保护与保护基的脱除、以及变复性等诸多有机体系，步骤繁琐复杂，二硫键易错配，产率低下，且未能实现多肽类药物的绿色制造。而对于重组表达法，由于MarTX毒素分子量较小，且含多对二硫键易导致包涵体表达，因此运用该方法较难获得大量的、可溶的、高纯度蛋白。因此，本领域迫切需要开发一种MarTX毒素的制备方法，以获得高产量、高纯度和高活性的MarTX毒素生物活性蛋白。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种高产量、高纯度和高活性的MarTX毒素的制备方法。在本专利技术的第一方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白从N端到C端具有式I所示结构：P1-P2-P3-P4(式I)式中，P1为纯化标签元件；P2为麦芽糖结合蛋白元件(MBP)；P3为蛋白酶识别位点元件；P4为MarTX多肽元件；“-”表示连接上述元件的肽键。在另一优选例中，所述P1为6×His序列。在另一优选例中，所述融合蛋白可不包括P1元件。在另一优选例中，所述P2的序列为SEQIDNO:4.在另一优选例中，所述P2的序列为在SEQIDNO:4的基础上进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加，所得到的氨基酸序列。在另一优选例中，所述蛋白酶选自下组：HRV3C蛋白酶、Thrombin酶、FactorXa、肠激酶(Enterkinase)、TEV酶、Prescission、TAGZyme、SUMO蛋白酶，或其组合。在另一优选例中，所述蛋白酶为Thrombin酶。在另一优选例中，所述P4的序列为SEQIDNO:2。在另一优选例中，所述P4的序列为在SEQIDNO:2的基础上进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加，所得到的氨基酸序列。在另一优选例中，所述式I的序列的N端或C端可添加1至30个氨基酸残基，较佳地1至10个氨基酸残基，更佳地1至5个氨基酸残基。在另一优选例中，所述P1和P2之间、P2和P3之间，或P3和P4之间，可添加1至30个氨基酸残基，较佳地1至10个氨基酸残基，更佳地1至5个氨基酸残基。在另一优选例中，所述融合蛋白的序列中，从N端到C端各元件之间的排序还包括：P2-P1-P3-P4、P4-P3-P2-P1、P2-P3-P4-P1或P4-P3-P1-P2。在本专利技术的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本专利技术第一方面所述的融合蛋白。在另一优选例中，所述多核苷酸包括从5’到3’的式II的核酸构建物，Z1-Z2-Z3-Z4(式II)式中，Z1、Z2、Z3和Z4分别编码本专利技术第一方面中式I中的P1、P2、P3和P4；其中，所述Z2的序列为SEQIDNO:3。在另一优选例中，所述Z4的序列为SEQIDNO:1。在另一优选例中，所述多核苷酸的序列中，从5’到3’各元件之间的排序还包括：Z2-Z1-Z3-Z4、Z4-Z3-Z2-Z1、Z2-Z3-Z4-Z1或Z4-Z3-Z1-Z2。在本专利技术的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有本专利技术第二方面所述的多核苷酸。在另一优选例中，所述载体为pETDuet-MarTX-1，所述pETDuet-MarTX-1为在载体pETDuet-1中插入序列SEQIDNO:3所得。在本专利技术的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本专利技术第三方面所述的载体或基因组中整合有本专利技术第二方面所述的多核苷酸。在另一优选例中，所述宿主细胞为E.coliOrigamiB(DE3)。在本专利技术第五方面，提供了一种产生本专利技术第一方面所述的融合蛋白的方法，包括步骤：在适合表达的条件下，培养本专利技术第四方面所述的宿主细胞，从而表达出本专利技术第一方面所述的融合蛋白。在本专利技术第六方面，提供了一种制备MarTX多肽的方法，包括步骤：(i)用蛋白酶对本专利技术第一方面所述的融合蛋白酶切，从而获得酶切产物，该酶切产物对应于MarTX多肽；和(ii)从酶切产物中分离或纯化出所述的MarTX多肽。在另一优选例中，所述蛋白酶选自下组：HRV3C蛋白酶、Thrombin酶、FactorXa、肠激酶(Enterkinase)、TEV酶、Prescission、TAGZyme、SUMO蛋白酶，或其组合。在另一优选例中，所述蛋白酶为Thrombin酶。在另一优选例中，所述方法纯化得到的MarTX多肽，从每升表达菌体所得的产量为≥2mg，较佳地≥3mg，更佳地≥4mg。在本专利技术第七方面，提供了一种(α+β4)BK通道电流抑制剂的药物筛选方法，包括步骤：(i)使用本专利技术第六方面所述的方法，纯化制备MarTX多肽；(ii)以MarTX多肽作为阳性对照，对(α+β4)BK通道电流抑制剂候选药物进行筛选。在另一优选例中，所述步骤(ii)中，MarTX多肽阻断(α+β4)BK通道电流的半数效应浓度(EC50)值为C0，所述抑制剂候选药物阻断(α+β4)BK通道电流的半数效应浓度(EC50)值为C1，当C1≤C0时，则所述抑制本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白从N端到C端具有式I所示结构：P1‑P2‑P3‑P4 (式I)式中，P1为纯化标签元件；P2为麦芽糖结合蛋白元件(MBP)；P3为蛋白酶识别位点元件；P4为MarTX多肽元件；“‑”表示连接上述元件的肽键。
【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白从N端到C端具有式I所示结构：P1-P2-P3-P4(式I)式中，P1为纯化标签元件；P2为麦芽糖结合蛋白元件(MBP)；P3为蛋白酶识别位点元件；P4为MarTX多肽元件；“-”表示连接上述元件的肽键。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述P2的序列为SEQIDNO:4。3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述P4的序列为SEQIDNO:2。4.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白。5.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求4所述的多核苷酸。6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求5所述的载体或基因组中整合有权利要求4所述的多核苷酸。7.如权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹春阳，刘新莲，陶杰，吉永华，蓝文贤，
申请(专利权)人：中国科学院上海有机化学研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31
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