基因改造的干细胞及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，尤其涉及基因改造的干细胞及其应用。本发明专利技术提供了基因改造的干细胞，该干细胞能够表达融合蛋白Pdx‑1‑Linker‑IGF‑1，能够高效分化成为胰岛样细胞团。实验表明，诱导5天转化率可达90％，胰岛素分泌量可达125±16pg/mL。与其他各组相比，经基因转化后的干细胞具有更强的胰岛细胞转化效果。

【技术实现步骤摘要】
基因改造的干细胞及其应用
本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及基因改造的干细胞及其应用。
技术介绍
糖尿病(DiabetesMellitus,DM)是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。糖尿病时长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。据世界卫生组织推荐的分型，可将糖尿病分为以胰岛素绝对不足为主的I型糖尿病和以胰岛素相对不足且胰岛素抵抗为主的II型糖尿病两种类型。其中，约10％的患者属于I型糖尿病，遗传因素在该型糖尿病中的重要性高达50％，发病常见于儿童和青少年人群。另外，90％的患者属于II型糖尿病，是一种多基因遗传因素、环境因素联合作用引起的代谢性疾病，具有很高的遗传倾向，多见于40岁以上的成年患者。目前在糖尿病的临床治疗上，通过注射胰岛素来控制血糖虽然是一种有效的缓解措施，但并不能彻底治愈糖尿病，还有可能造成低血糖等风。真正根治糖尿病将是恢复机体内功能性胰岛β细胞的数量和消除糖尿病引发的各种并发症。其中，进行胰岛移植是治疗I型糖尿病和部分II型糖尿病最有效的方法之一。但是，由于供体来源严重不足以及器官移植将面临终身免疫抑制治疗等问题，极大地限制了胰岛移植在临床治疗上的广泛应用。近年来，由干细胞体外定向诱导分化成胰腺祖细胞和功能性胰岛来进行移植，为我们提供了一个全新的细胞替代疗法。自体诱导分泌胰岛素细胞微球可以有效的缓解病人的痛苦，同时该技术是以自体间充质干细胞为基础，能够从根本上避免免疫排斥问题以及其他传染性疾病的困扰，并且利用自体细胞可以更有效的发挥其修复作用，使移植细胞更好的与胰岛相结合，并最终替代损伤的胰岛细胞，进而达到修复其功能的作用。但是，目前的技术对干细胞的诱导效率较低，尚无法满足临床的应用。因此，应进一步研究，提高干细胞体外定向诱导分化成为分泌胰岛素的细胞的效率。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供基因改造的干细胞及其应用，该干细胞体外定向分化为分泌胰岛素的细胞的效率较高。由于骨髓干细胞本身具有可诱导成型的特点可将其改造成胰岛素分泌性细胞，但是普通诱导方法效果并不是很好，因此采用慢病毒转基因加后期诱导的方法，对干细胞进行改造。本专利技术提供了一种融合蛋白Pdx-1-Linker-IGF-1，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。Pdx1基因是胰十二指肠同源盒基因-1，是控制胰腺细胞正常发育和维持胰岛素正常分泌的基因。Pdx-1基因最终转录为Pdx-1蛋白，其具有283个氨基酸，分子量约为31kDa。主要利用氨基端和胰岛素基因启动子区域结合，进而调控胰岛素基因的转录以及表达，同时引导胰岛素mRNA从细胞核中转移到核外。IGF-1胰岛素样生长因子是具有促进生长的多肽结构的分泌性激素，多功能细胞调控因子，对细胞的生长，促进组织的发育和细胞转化，以及生理代谢等起到了极强的作用。本专利技术充分利用Pdx-1和IGF-1的特性，设计了以G3S(即GGGS，G:甘氨酸，S:丝氨酸)为柔性链接的表达Pdx-1和IGF-1的融合蛋白。通过基因表达慢病毒载体，将Pdx-1于IGF-1的融合基因嵌入到干细胞基因组中，促使干细胞最终能表达Pdx-1-Linker-IGF-1融合蛋白。通过G3S柔性链连接到一起的融合蛋白同时具有Pdx-1和IGF-1两个蛋白的性质，既可以促进干细胞分泌胰岛素同时又具有定向促进细胞的生长，并且能够很好的促进干细胞像类胰岛细胞及组织进行转化，从而达到修复胰岛组织的作用。本专利技术还提供了表达融合蛋白Pdx-1-Linker-IGF-1的DNA分子。所述表达融合蛋白Pdx-1-Linker-IGF-1的DNA分子的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术还提供了包含所述DNA分子的质粒载体。本专利技术实施例中，其骨架载体为pRRLSIN.cPPT.PGK-WPRE载体(图谱如图1)。本专利技术中，所述质粒载体中，表达融合蛋白Pdx-1-Linker-IGF-1的DNA分子的插入位点为BamHI，SalI。本专利技术还提供了一种慢病毒，其由本专利技术所述的质粒载体与慢病毒包装质粒共转染293T细胞构建获得。所述慢病毒包装质粒为pMD2G(表达VSVG包膜蛋白)和pCMVR8.74(表达HIV-1Gag,Pol,TatandRev蛋白)。所述共转染采用CaCl2转染。本专利技术利用pMD2G和pCMVR8.74来表达HIV-1病毒的基本组件，将目标基因Pdx-1-Linker-IGF-1嵌入到pRRL质粒载体上，制备出含有目标基因的慢病毒载体，并将目标基因有效的整合到宿主细胞(干细胞)的染色体上，并最终实现表达目的序列的效果。所述慢病毒的制备方法为：将293T细胞与本专利技术所述的质粒载体和pMD2G、pCMVR8.74质粒混合，以含有CaCl2的HeBS缓冲液，37℃，5％CO2培养后收集上清液，经过滤、离心收集病毒。表达融合蛋白Pdx-1-Linker-IGF-1的干细胞。本专利技术所述的干细胞为骨髓干细胞。一些实施例中，所述骨髓干细胞为自体骨髓干细胞。本专利技术所述干细胞的制备方法，其以本专利技术所述的慢病毒感染干细胞获得。具体的，以本专利技术所述的慢病毒感染骨髓干细胞制得。所述感染为：将病毒悬液和完全培养基混合后加入含有干细胞的培养皿中，37℃孵育。4小时后，再加入一定量的完全培养基，37℃孵育，继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基，继续培养获得所述干细胞。本专利技术所述干细胞在制备治疗糖尿病的制剂中的应用。本专利技术还提供了一种治疗糖尿病的制剂，其包括本专利技术所述干细胞。本专利技术所述制剂的制备方法，其将本专利技术所述干细胞以含有30mmol/L葡萄糖和10mmol/LC肽的完全培养基诱导分化成为胰岛样细胞团，添加辅料制成所述制剂。本专利技术提供了基因改造的干细胞，该干细胞能够表达融合蛋白Pdx-1-Linker-IGF-1，能够高效分化成为胰岛样细胞团。实验表明，诱导5天转化率可达90％，胰岛素分泌量可达125±16pg/mL。与其他各组相比，经基因转化后的干细胞具有更强的胰岛细胞转化效果。附图说明图1示质粒图谱；其中图1-a示pRRLSIN.cPPT.PGK-WPRE的质粒图谱；图1-b示pRRLSIN.cPPT.PGK-Pdx-1-Linker-IGF-1-WPRE的质粒图谱；图2示显微镜下观察诱导分化干细胞的检测结果，图2-a为未进行双硫腙染色的细胞，图2-b为经过双硫腙染色后胰岛样细胞团被染成铁红色；图3示胰岛素分泌趋势。具体实施方式本专利技术提供了基因改造的干细胞及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。本专利技术采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本专利技术：实施例1人工合成SEQIDNO:2所示的DNA片段，以BamHI，SalI，酶切位点BamHI：G^GATCC，4021，SalI：G^本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.融合蛋白Pdx‑1‑Linker‑IGF‑1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.融合蛋白Pdx-1-Linker-IGF-1，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。2.表达权利要求1所述融合蛋白Pdx-1-Linker-IGF-1的DNA分子。3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。4.含有权利要求2～3任一项所述DNA分子的质粒载体。5.根据权利要求4所述的质粒载体，其特征在于，其骨架载体为pRRLSIN.cPPT.PGK-WPRE载体。6.一种慢病毒，其特征在于，由权利要求4～5任一项所述的质粒载体与慢病毒包装质粒共转染293T细胞构建获得。7.表达融合蛋白Pd...

【专利技术属性】
技术研发人员：王立坚，赵钢，王竑婷，
申请(专利权)人：长春万成生物电子工程有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林,22