第三代LMP2A CAR-T细胞的制备方法及其应用技术

本发明专利技术利用基因工程技术，以具有高亲和力的全人源抗LMP2A Fab为模板，构建靶向LMP2A的嵌合抗原受体的胞外区LMP2A scFv段。重组LMP2A CAR的胞外区LMP2A scFv段与信号肽CD8α、跨膜区CD8

Preparation and Application of Third Generation LMP2A CAR-T Cells

The present invention utilizes genetic engineering technology to construct the extracellular LMP2A scFv segment targeting the chimeric antigen receptor of LMP2A, using the full-human anti-LMP2A Fab with high affinity as a template. Extracellular LMP2A scFv segment of recombinant LMP2A CAR and signal peptide CD8alpha and transmembrane CD8

【技术实现步骤摘要】
第三代LMP2ACAR-T细胞的制备方法及其应用
本专利技术属于基因工程领域和免疫靶向治疗领域，涉及第三代LMP2ACAR-T细胞的制备方法及其应用。
技术介绍
鼻咽癌是来源于鼻咽上皮的高度恶性肿瘤，肿瘤进展极易侵犯颅底等重要结构，并较早发生颈部淋巴结转移和远处转移。鼻咽癌表现为种族和地区分布的特点，是我国十大高发恶性肿瘤之一，其发病率为20/100,000，已引发严重健康问题。目前鼻咽癌的主要治疗方式为放化疗，但由于首发症状的不典型，患者就诊时往往已属于病程中晚期，其五年生存率并不高，病灶的复发与转移是其死亡的主要原因。近年来，以T细胞过继性免疫治疗为基础的嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，CAR)T细胞治疗相继于血液系统恶性肿瘤与部分实体瘤中取得了显著的成果，为其在鼻咽癌中的应用提供了可能。鼻咽癌是由Epstein-Ban病毒(EBV)的潜伏感染、环境因素和宿主的基因遗传因素共同参与的多步骤交互作用而逐步形成的复杂性疾病。所有的鼻咽癌细胞都含有EBV基因组，并表达EBNA1，EBER1，EBER2,和LMP2A，LMP2A，LMP2B，这使得这些病毒蛋白成为理想的肿瘤标志物，其中LMP2A(latentmembraneproteinl，LMP2A)在鼻咽上皮细胞的转化和癌变过程中的作用倍受注。LMP2A普遍存在于鼻咽癌组织中，而在正常鼻咽上皮中并不表达，具有良好的特异性，成为鼻咽癌CAR-T细胞治疗的优良靶点。目前，在鼻咽癌的CAR-T细胞治疗领域尚未有第三代的LMP2ACAR-T细胞成功制备的报道。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种靶向LMP2A的嵌合抗原受体(即LMP2ACAR)。本专利技术的第二个目的是提供含有前述靶向LMP2A的嵌合抗原受体的抗LMP2ACAR的慢病毒重组表达载体。本专利技术的第三个目的是提供前述抗LMP2ACAR的慢病毒重组表达载体的制备方法。本专利技术的第四个目的是提供前述的抗LMP2ACAR的慢病毒重组表达载体感染T细胞获得的LMP2ACAR-T细胞。本专利技术的第五个目的是提供前述LMP2ACAR-T细胞的制备方法。本专利技术的第六个目的是提供前述的靶向LMP2A的嵌合抗原受体、抗LMP2ACAR的慢病毒重组表达载体、LMP2ACAR-T细胞在制备鼻咽癌诊断试剂或鼻咽癌免疫治疗药物中的应用。专利技术人以具有高亲和力的全人源抗LMP2A抗体Fab为模板，根据InfusionPCR的原理设计重、轻链引物，分别扩增重、轻链可变区，并以连接肽即铰链区(Gly4Ser)3连接重、轻链可变区构建靶向LMP2A的嵌合抗原受体胞外区的LMP2AscFv段。在成功构建的靶向LMP2A的嵌合抗原受体胞外区的LMP2AscFv的5'端连接信号肽序列CD8α。利用overlapPCR的方法，CD8α标记的LMP2AscFv段与基因工程合成的CD8TM，CD28，CD137以及CD3ζ重组构成LMP2ACAR。此外，将线性化的慢病毒载体与靶向LMP2A的嵌合抗原受体进行重组，获得抗LMP2ACAR的慢病毒表达质粒。Westernblot验证抗LMP2ACAR的慢病毒表达质粒在X-293T细胞中的表达后，经三质粒慢病毒包装体系制备LMP2ACAR慢病毒液，感染T细胞，制备LMP2ACAR-T细胞。进一步通过体内外实验检测LMP2ACAR-T细胞对LMP2A阳性鼻咽癌细胞的特异性靶向杀伤功能。CCK8法显示该LMP2ACAR-T细胞对鼻咽癌细胞株CNE1及LV-LMP2A-CNE1的生长抑制作用；ELISA法检测显示鼻咽癌细胞与LMP2ACAR-T细胞共培养后，LMP2ACAR-T细胞分泌细胞因子(IL-2、IFN-γ)的能力，其中IL-2用于维持CAR-T细胞的活性，保持其增殖能力，而起杀伤作用的是细胞因子IFN-γ；体外动物实验检测LMP2ACAR-T细胞在体内对LMP2A阳性鼻咽癌移植瘤的抑瘤作用，证实LMP1CAR-T细胞在制备鼻咽癌诊断试剂或鼻咽癌免疫治疗药物中的有效性。本专利技术具体技术方案如下：一种靶向LMP2A的嵌合抗原受体，所述靶向LMP2A的嵌合抗原受体由从氨基端到羧基端依次连接的信号肽CD8α、胞外区LMP2AscFv、跨膜区CD8TM和胞内区组成。进一步的，所述胞外区LMP2AscFv由重链可变区(即VH)、连接肽(即铰链区)、轻链可变区(即Vκ)依次连接组成，所述重链可变区氨基酸序列如SEQIDNO.3所示：QLLESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDWKQHWYFDLWGRGTLVTVSS，轻链可变区氨基酸序列如SEQIDNO.4所示：ELQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNVYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKLEIK，连接肽为串联的三组五肽重复单元(Gly4Ser)3。进一步的，编码所述重链可变区氨基酸的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示：CAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATTGGAAACAGCACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA，编码所述轻链可变区氨基酸的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示：GAGCTCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA，编码所述连接肽的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示：GGAGGAGGAGGATCAGGCGGCGGAGGCAGCGGAGGAGGAGGGTCC。胞外区LMP2AscFv的氨基酸序列如SEQIDNO.17所示，编码所述胞外区LMP2AscFv氨基酸的核苷酸序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向LMP2A的嵌合抗原受体，其特征在于，所述靶向LMP2A的嵌合抗原受体由从氨基端到羧基端依次连接的信号肽CD8α、胞外区LMP2A scFv、跨膜区CD8TM和胞内区组成。

【技术特征摘要】
1.一种靶向LMP2A的嵌合抗原受体，其特征在于，所述靶向LMP2A的嵌合抗原受体由从氨基端到羧基端依次连接的信号肽CD8α、胞外区LMP2AscFv、跨膜区CD8TM和胞内区组成。2.根据权利要求1所述的靶向LMP2A的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞外区LMP2AscFv由重链可变区、连接肽、轻链可变区依次连接组成，所述重链可变区氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，连接肽为串联的三组五肽重复单元(Gly4Ser)3。3.根据权利要求2所述的靶向LMP2A的嵌合抗原受体，其特征在于，编码所述重链可变区氨基酸的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，编码所述轻链可变区氨基酸的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，编码所述连接肽的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。4.根据权利要求1所述的靶向LMP2A的嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号肽CD8α的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示，编码信号肽CD8α的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，所述编码信号肽CD8α的核苷酸序列连接在LMP2AscFv重链可变区的5'端。5.根据权利要求1所述的靶向LMP2A的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜区CD8TM的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示，编码所述跨膜区CD8TM氨基酸的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。6.根据权利要求1所述的靶向LMP2A的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内区由CD28、CD137、CD3ζ依次连接组成；所述CD28的氨基酸序列如SEQIDNO.11所示，编码所述CD28氨基酸的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示；所述CD137的氨基酸序列如SEQIDNO.13所示，编码所述CD137氨基酸的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；所述CD3ζ的氨基酸序列如SEQIDNO.15所示，编码所述CD3ζ氨基酸的核苷酸序列如SEQIDNO.14所示。7.抗LMP2ACAR的慢病毒重组表达载体，其特征在于，所述抗LMP2ACAR的慢病毒重组表达载体含有权利要求1至6任一项所述靶向LMP2A的嵌合抗原受体。8.权利要求7所述抗LMP2ACAR的慢病毒重组表达载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：以全人源抗LMP2A抗体Fab为模板，设计重链可变区特异性引物对和轻链可变区特异性引物对，分别扩增重链可变区和轻链可变区；采用重、轻链连...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈仁杰，冯振卿，朱进，唐奇，陈渊，张舒，张大为，
申请(专利权)人：南京医科大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32