多表位抗原及其制备方法与在制备防治鹦鹉热衣原体感染的药物中的应用技术

本发明专利技术涉及免疫学技术领域，尤其涉及多表位抗原及其制备方法与在制备防治鹦鹉热衣原体感染的药物中的应用。本发明专利技术提供了SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多表位抗原、包括该抗原的融合多肽及该融合多肽的用途。该抗原分子量小，制备简单，免疫原性与大分子蛋白相当。实验表明，该抗原能够诱导体液和Th1细胞免疫反应产生，产生具有显著意义的特异性抗体以及γ干扰素、白介素2。疫苗接种能显著降低感染小鼠肺组织的衣原体载量以及炎症侵润程度，并显著降低炎性因子IFN‑γ和IL‑6水平。此外，从接种疫苗的小鼠身上获得的CD4+T细胞，经过继转移后显著降低了感染小鼠肺组织的衣原体载量，表明其在细胞免疫应答中具有重要意义。

Multi-epitope antigen and its preparation method and its application in the preparation of drugs against Chlamydia psittaci infection

The invention relates to the field of immunology technology, in particular to a multi-epitope antigen and its preparation method and its application in the preparation of drugs for preventing and treating Chlamydia psittaci infection. The invention provides a multi-epitope antigen of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1, a fusion polypeptide including the antigen, and the use of the fusion polypeptide. The antigen has low molecular weight, simple preparation, and its immunogenicity is similar to that of macromolecular proteins. Experiments show that the antigen can induce humoral and Th1 cell immune response, and produce significant specific antibodies, interferon-gamma and interleukin-2. Vaccination could significantly reduce the Chlamydia load and inflammatory invasion in lung tissue of infected mice, and significantly reduce the levels of inflammatory factors IFN_gamma and IL_6. In addition, CD4 + T cells obtained from vaccinated mice significantly reduced the Chlamydia load in lung tissues of infected mice after subsequent metastasis, suggesting that CD4 + T cells play an important role in cellular immune response.

【技术实现步骤摘要】
多表位抗原及其制备方法与在制备防治鹦鹉热衣原体感染的药物中的应用
本专利技术涉及免疫学
，尤其涉及多表位抗原及其制备方法与在制备防治鹦鹉热衣原体感染的药物中的应用。
技术介绍
鹦鹉热衣原体是一种人畜共患病原体，可导致禽类和鸟类的鹦鹉热、鸟疫，以及人类的非典型肺炎。鹦鹉热衣原体的特征包括临床疾病的爆发过程和非常广泛的宿主范围。人类可通过吸入感染鸟类的尿液、粪便或其他排泄物的污染气溶胶发生感染。在成功传播给人类后，主要表现为呼吸道感染、菌血症，而在感染早期主要引起社区获得性肺炎。如不及时治疗，则可能导致包括脑炎和心肌炎等更加严重的并发症。衣原体感染虽然可以通过抗生素治疗有效控制，但它很容易复发。因此，安全有效的疫苗被认为是预防鹦鹉热衣原体感染和减少衣原体疾病传播最有效的方法。理想的候选抗原应该包含多个B细胞和T细胞表位，当抗原呈递细胞与MHCI类、MHCII类分子结合呈现抗原时，可诱导产生免疫应答。以往的研究表明，鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白(MOMP)是一种高度保守的蛋白，可诱导动物模型产生特异性的抗衣原体免疫应答。此外，鹦鹉热衣原体MOMP可能是存在较多T细胞和B细胞表位潜在候选抗原。质粒是衣原体中重要的毒力因子，包含8个开放阅读框(ORFs)，分别编码8个质粒蛋白。重组质粒蛋白Pgp3或Pgp4免疫可显著降低鼠衣原体载量，减轻感染小鼠肺部炎症反应。在我们之前的研究中，鹦鹉热衣原体的质粒编码CPSIT_p8(pgp4)蛋白在BALB/c小鼠体内免疫接种三次后，诱导了产生显著的免疫保护作用。CPSIT_p6蛋白与CPSIT_p8具有相似的功能，由于其序列较长，潜在表位较多，更适合于优势区域的筛选。目前，鹦鹉热衣原体的疫苗都是以蛋白为抗原的，主要是以鹦鹉热衣原体MOMP和CPSIT_p6蛋白。相较于常规的减毒活疫苗以及亚单位重组蛋白疫苗，多肽疫苗其优势在于：1.特异性强、免疫靶向性好：针对复杂的非连续性抗原片段，构建相应的合成抗原多肽。其融合了不同的T细胞以及B细胞表位能够产生特异性更强的抗衣原体抗体，更具针对性，并能够直接靶向作用于体内的衣原体；2.毒副作用小、排异反应少：由于合成过程我们只选取了抗原性较强的细胞表位片段，因此不含蛋白抗原中的高反应原性成分(脂多糖、毒素)。同时还能够去除对免疫个体本身分子具有致敏性和交叉反应活性的抗原片段，进而最大程度地减少了毒副反应以及排异反应的发生；3.生产技术安全、高效：在多肽片段合成过程中，成熟的合成技术可以将不同抗优势抗原表位有效地融合在一个载体上，同时使片段纯度达到90％以上，远远高于蛋白抗原。而高纯度的融合多肽相较于纯度较低的重组蛋白而言，也能够大大降低非抗原物质对免疫过程影响；4.结构稳定，不易变性：重组多肽的线性结构不同于蛋白的空间结构，其抗原结构更加稳定，在免疫过程中不会产生新的空间构象而影响免疫效果。因此，与以蛋白为抗原的疫苗相比，多肽疫苗更适于作为候选的抗衣原体感染疫苗。但是，虽然多肽疫苗存在诸多优势，但优势表位的筛选始终是多肽疫苗开发中的难题之一，由于一个蛋白可存在多个表位，而多肽片段较短，其表位的筛选始终是本领域的研究热点。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供多表位抗原及其制备方法与在制备防治鹦鹉热衣原体感染的药物中的应用。本专利技术提供了如SEQIDNO:1所示氨基酸序列的多表位抗原。所述“抗原表位”指抗原上的一种位点，也称做“抗原决定簇”或“抗原决定族位点”，其实质是一种多肽。B细胞和T细胞对该位点可发生特异性应答反应。本专利技术选择两段来自CPSIT_p6蛋白的表位和两段来自MOMP的表位，通过GGGG(gly-gly-gly-gly)连接子进行连接，获得本专利技术所述的多表位抗原。该多表位抗原片段仅含有52个氨基酸，但其效果与大分子蛋白MOMP或CPSIT_p6为抗原的相当。本专利技术将上述抗原表位与载体蛋白偶联，形成融合多肽。所述载体蛋白可为KLH(KeyholeLimpetHemocyanin)或BSA。一些实施例中，选用KLH蛋白作为载体蛋白。本专利技术还提供了一种融合多肽，其包括如SEQIDNO:1所示氨基酸序列和KLH蛋白序列。所述融合多肽中，KLH可位于SEQIDNO:1所示氨基酸序列的C端或N端。一些实施例中，KLH位于SEQIDNO:1所示氨基酸序列的C端。本专利技术还提供了编码所述抗原或融合多肽的DNA分子。本专利技术所述抗原或融合多肽可采用人工合成的方式获得，也可通过基因工程的手段合成。本专利技术对此不做限定。当其采用基因工程方式合成时，将编码的DNA分子通过表达质粒载体转化入生物体内，诱导表达获得所述抗原或融合多肽。本专利技术所述多表位抗原或融合多肽在制备治疗性抗体、疫苗和/或检测试剂盒中的应用。以往的研究表明，IgM和IgG分别在衣原体感染的早期和晚期发挥保护作用。因此，血清中IgG、IgA和IgM在末次免疫后14天从免疫小鼠中收集，并通过ELISA检测这些抗体的水平。研究表明，以本专利技术提供的多表位抗原免疫组诱导IgG、IgA和IgM的抗体水平明显高于FA-和pbc免疫组(P<0.01)。多表位抗原诱导产生的血清IgG亚型(IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体)水平也明显高于对照组。本专利技术所述治疗性抗体或疫苗的作用包括：介导Th1型细胞免疫应答、降低炎症因子水平、降低鹦鹉热衣原体载量、促进CD4+或CD8+细胞的免疫应答。本专利技术还提供了一种预防鹦鹉热衣原体感染的疫苗，其包括本专利技术所述融合多肽。所述的疫苗的制备采用本领域常规采用的各种方法，例如，将所述融合多肽与适宜的药用载体和/或媒介物配制本专利技术的疫苗。所述药物载体可采用无菌盐水，也可使用其它水性或非水性等渗无菌注射液以及水性和非水性无菌悬浮液。另外，本专利技术的疫苗的配制还可含有其它药学上可接受的辅料，包括：佐剂、稳定剂、pH调节剂或防腐剂等。另外，在制剂中也可包含调节免疫应答的其它成分，例如：IL-12、CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)等。具体的佐剂采用弗氏佐剂。具体的，疫苗的免疫包括三次，初免采用的疫苗采用完全弗氏佐剂进行乳化，而第二次、第三次免疫采用与不完全弗氏佐剂乳化。本专利技术还提供了一种预防鹦鹉热衣原体感染的方法，其为给予本专利技术所述的疫苗。所述治疗的方案中，疫苗可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。本专利技术还提供了一种治疗鹦鹉热衣原体感染的药物，其包括由所述融合多肽制得的治疗性抗体。本专利技术还提供了包含本专利技术所述融合多肽的各种组合物，特别是药物组合物或疫苗组合物。该组合物可有效用于治疗和/或防治鹦鹉热衣原体感染引起的相关的病症。所述组合物中，还包括其他治疗剂。所述其他治疗剂选自其他用于治疗或预防鹦鹉热衣原体感染的药物。本专利技术所述的组合物的剂型包括但不限于：注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾、栓剂、透皮药物(如贴片等)、油膏、洗剂等。本专利技术还提供了一种治疗鹦鹉热衣原体感染的方法，其为给予本专利技术所述的药物。本专利技术还提供了一种试剂盒，其包括所述融合多肽，和/或与所述融合多肽相互作用的抗体。本专利技术中，所述试剂盒还包含检测与所述融合多肽和/或与融合多肽相互作用的抗体的检测试剂。所述检测试剂应用于本领域熟知的免疫本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多表位抗原。

【技术特征摘要】
1.如SEQIDNO:1所示氨基酸序列的多表位抗原。2.一种融合多肽，其包括如SEQIDNO:1所示氨基酸序列和KLH蛋白序列。3.根据权利要求2所述的融合多肽，其特征在于，KLH位于SEQIDNO:1所示氨基酸序列的C端。4.编码权利要求1所述抗原或权利要求2～3任一项所述融合多肽的DNA分子。5.权利要求2所述多表位抗原或权利要求2～3任一项所述融合多肽在制备治疗性抗体、疫苗和/或检测试剂盒中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述治疗性抗体或疫苗的作用包括：介导Th1型细胞免疫应答、降低...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴移谋，李育萌，王川，
申请(专利权)人：南华大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43