一种达旦提狄克氏菌TaqMan荧光定量PCR检测方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种达旦提狄克氏菌TaqMan荧光定量PCR检测方法及应用。该检测方法所用到的引物及探针包括引物Ddad3、Ddad4和TaqMan探针Addad2，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。该检测方法包括以下步骤：提取待测样品DNA；以样品DNA为模板，加入上述的达旦提狄克氏菌TaqMan荧光定量PCR检测的引物及探针，进行实时荧光定量PCR检测；根据Ct值和预期扩增曲线判断检测样品中是否含有达旦提狄克氏菌。本发明专利技术建立的基于TaqMan探针的荧光定量PCR检测体系可用于甘薯茎腐病疑似样本、病残体、田间土壤和种薯种苗的快速检测。

A TaqMan Fluorescent Quantitative PCR Method for Detection of Dictylella Dadantii and Its Application

The invention discloses a TaqMan fluorescent quantitative PCR detection method for Dictylla dardantii and its application. The primers and probes used in this method include primers Ddad3, Ddad4 and TaqMan probe Addad2, whose nucleotide sequences are shown as SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2 and SEQ ID NO.3, respectively. The detection method includes the following steps: extracting the DNA of the sample to be tested; adding the primers and probes for TaqMan fluorescence quantitative PCR detection of the above-mentioned strain of Dictyostella dantii to detect real-time fluorescence quantitative PCR; judging whether there is Dictyostella dantii in the detected sample according to the CT value and expected amplification curve. The fluorescence quantitative PCR detection system based on TaqMan probe established by the invention can be used for rapid detection of suspected samples of sweet potato stem rot, disease residues, field soil and seed potato seedlings.

【技术实现步骤摘要】
一种达旦提狄克氏菌TaqMan荧光定量PCR检测方法及应用
本专利技术属于分子生物学领域，具体地说，涉及一种达旦提狄克氏菌TaqMan荧光定量PCR检测方法及应用。
技术介绍
达旦提狄克氏菌Dickeyadadantii被列入国际公认的十大类分子植物病原细菌之一，引起的甘薯茎腐病是近年来我国甘薯上发生最严重的细菌病害，在浙江、广东、河北、河南均有发生危害。甘薯茎腐病严重影响国内甘薯产业的发展，对浙江番薯产业的影响最为严重，2016年列入浙江省植物检疫性有害生物补充名录。甘薯茎腐病通过种薯种苗进行远距离传播，对种薯种苗进行早期检测，能够阻止病害从病区传播到无病区，能够有效降低老病区的发病率，及时采取相关防控措施，控制病害的进一步扩展。目前，达旦提狄克氏菌检测技术主要是对病健交界处进行划线分离培养纯化结合多基因序列测定分析和MALDI-TOF质谱微生物鉴定,费时费力，不适合种薯种苗带菌情况、田间疑似样本的快速检测。Smid等(VanDerWolfJM,NijhuisEH,KowalewskaMJ,etal.Dickeyasolanisp.nov.,apectinolyticplantpathogenicbacteriumisolatedfrompotato(Solanumtuberosum)[J].IntJSystEvolMicrobiol,2014,64(3):768-74.)和刘鹏等(LiuP,HuangGM,LiuY,etal.MoleculardetectionofErwiniachrysanthemi(inChinese)[J].ActaPhytopathologicaSinica(植物病理学报),2007,37(6):584-587.)分别基于Dickeya属(formerlyErwiniachrysanthemi)的rDNAITS序列设计的特异性引物，能扩增出特异性片断的菌只能说明是Dickeya属或“以往”菊欧文氏菌的菌，作为D.dadantii辅助的鉴定有一定的参考价值，但是不能区分Dickeya属下的8个种，因为这8个种的同源性很高，基于16SrDNA序列设计的特异性引物无法区分。基于特定脂肪酸组成特性而研制的GC-FAME微生物鉴定系统和基于95种碳源的利用情况而研制的BIOLOG微生物鉴定系统这二个鉴定系统中目前还没有D.dadantii标准菌株的相关信息,即使有标准菌株的信息如MALDI-TOF质谱微生物鉴定，也需先分离纯化得到单菌落，不适于作快速检测。因此，有效快速甘薯茎腐病原检测方法亟待解决。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种达旦提狄克氏菌TaqMan荧光定量PCR检测方法及应用。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种达旦提狄克氏菌TaqMan荧光定量PCR检测的引物及探针，包括引物Ddad3、Ddad4和TaqMan探针Addad2，其中，Ddad3：5’-ACCCAGGCCACCAGAAGT-3’，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；Ddad4：5’-GACGGTACTGTTACCGCTAC-3’，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；TaqMan探针Addad2：5’-CAGTGGTGCCTGCGCCAAC-3’，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；其中，TaqMan探针Addad2的5’端标记荧光报告基因FAM，3’端标记荧光猝灭基团MGB。本专利技术还公开了一种达旦提狄克氏菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：(1)提取待测样品DNA；(2)以样品DNA为模板，加入上述的达旦提狄克氏菌TaqMan荧光定量PCR检测的引物及探针，进行实时荧光定量PCR检测；(3)根据Ct值和预期扩增曲线判断检测样品中是否含有达旦提狄克氏菌。可选地，所述的荧光定量PCR反应体系如下：Premix12.5μL，浓度为5μmol/LDdad3和Ddad4各1μL，浓度为10μmol/LTaqMan探针Addad21μL，ROXReferenceDyeII0.5μL，模板DNA1μL，ddH2O8μL，以上PCR反应总体系总量为25μL。可选地，所述的荧光定量PCR反应条件如下：95℃预变性10s；95℃变性15s，63℃退火延伸1min，40个循环。可选地，所述的步骤3中的根据Ct值和预期扩增曲线判断检测样品中是否含有达旦提狄克氏菌具体为：当无Ct值且无预期扩增曲线时，表示样品中不含达旦提狄克氏菌；当Ct值≤35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中含有达旦提狄克氏菌；当Ct值＞35.0，则该样品做重复实验；重复实验结果无Ct值，则该样品中不含达旦提狄克氏菌；若重复实验结果有Ct值，则该样品中含达旦提狄克氏菌。本专利技术还公开了一种达旦提狄克氏菌TaqMan荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包括上述的达旦提狄克氏TaqMan荧光定量PCR检测的引物及探针。本专利技术还公开了一种上述的引物及探针、检测方法和试剂盒在甘薯茎腐病疑似样本、病残体、田间土壤和种薯种苗检测中的应用。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：1)本专利技术将达旦提狄克氏菌编码鞭毛蛋白的fliC基因序列与近缘种比对发现，该基因特异性强，适合作为分子检测的靶标。以fliC基因为靶标，设计了特异性引物和TaqMan探针，建立了达旦提狄克氏菌荧光定量PCR检测方法。结果发现，该方法能特异识别达旦提狄克氏菌，检测灵敏度可达280fg·μL-1，是常规PCR的1000倍；检测最低限达1.5CFU·μL-1，灵敏度比常规PCR检测方法高100倍，且仅需1.5h即可完成检测。2)本专利技术的检测方法用于田间样本检测，达旦提狄克氏菌阳性检测率达90％，高于分离培养法和常规PCR检出结果。3)本专利技术建立的基于TaqMan探针的荧光定量PCR检测体系可用于甘薯茎腐病疑似样本、病残体、田间土壤和种薯种苗的快速检测。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本专利技术的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1是本专利技术D.dadantii与其相似菌基于fliC基因的序列比较；图2是本专利技术基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR方法的标准曲线；图3是本专利技术基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR方法的特异性；其中，3-A包含19份阳性菌(1-19)，2个阴性菌和1个空白对照(20-22)；3-B包含27个阴性菌(1-27)，2个阳性菌(28-29)和1个空白对照(30)；图4是本专利技术以DNA为模板的实时荧光定量PCR方法的灵敏度检测；其中，①：28ng·μL-1,②：2.8ng·μL-1,③：280pg·μL-1,④：28pg·μL-1,⑤：2.8pg·μL-1,⑥：280fg·μL-1,⑦：28fg·μL-1；图5是本专利技术以DNA为模板的常规PCR方法的灵敏度检测；其中，M:PlusIIDNAmarker；1-7依次是：28ng·μL-1,2.8ng·μL-1,280pg·μL-1,28pg·μL-1,2.8pg·μL-1,280fg·μL-1,28fg·μL-1；8：阴性对照(ddH2O)；图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种达旦提狄克氏菌TaqMan荧光定量PCR检测的引物及探针，其特征在于，包括引物Ddad3、Ddad4和TaqMan探针Addad2，其中，Ddad3：5’‑ACCCAGGCCACCAGAAGT‑3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；Ddad4：5’‑GACGGTACTGTTACCGCTAC‑3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；TaqMan探针Addad2：5’‑CAGTGGTGCCTGCGCCAAC‑3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；其中，TaqMan探针Addad2的5’端标记荧光报告基因FAM，3’端标记荧光猝灭基团MGB。

【技术特征摘要】
1.一种达旦提狄克氏菌TaqMan荧光定量PCR检测的引物及探针，其特征在于，包括引物Ddad3、Ddad4和TaqMan探针Addad2，其中，Ddad3：5’-ACCCAGGCCACCAGAAGT-3’，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；Ddad4：5’-GACGGTACTGTTACCGCTAC-3’，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；TaqMan探针Addad2：5’-CAGTGGTGCCTGCGCCAAC-3’，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；其中，TaqMan探针Addad2的5’端标记荧光报告基因FAM，3’端标记荧光猝灭基团MGB。2.一种达旦提狄克氏菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待测样品DNA；(2)以样品DNA为模板，加入权利要求1所述的达旦提狄克氏TaqMan荧光定量PCR检测的引物及探针，进行实时荧光定量PCR检测；(3)根据Ct值和预期扩增曲线判断检测样品中是否含有达旦提狄克氏菌。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的荧光定量PCR反应体系如下：Premix12.5μL，浓度为5μmol/LDdad3和Ddad4各1μL，浓度为10...

【专利技术属性】
技术研发人员：楼兵干，沈肖玲，易建平，仇智灵，王荣洲，李艳敏，
申请(专利权)人：浙江大学，杭州市临安区农业局，浙江省农业厅，
类型：发明
国别省市：浙江,33