鲜肉源沙门氏菌ERIC-PCR溯源方法技术

本发明专利技术公开了一种鲜肉源沙门氏菌ERIC‑PCR溯源方法，提取鲜肉源同一血清型沙门氏菌分离株基因组DNA作为模板，运用ERIC‑PCR技术扩增其序列，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后获得鲜肉源沙门氏菌分离株基因组DNA的ERIC‑PCR指纹图谱；应用Gel‑Pro Analyzer 4.0对ERIC‑PCR指纹图谱进行凝胶定量分析，矩阵化后用NTSYS‑pc进行UPGMA聚类分析；然后，通过对沙门氏菌分离株的基因分型结果与其采样时间、地点的比较，追溯其污染来源。该法通过ERIC‑PCR实现快速准确地溯源，弥补了传统分型方法的不足，具有简便、分辨率高、重现性好、费用低廉的特点，可在基层推广。

ERIC-PCR Traceability of Salmonella from Fresh Meat

The invention discloses a traceability method for Salmonella ERIC PCR, a fresh meat source. The genomic DNA of Salmonella isolates from the fresh meat source is extracted as a template, and ERIC sequence PCR technique is used to amplify the sequence. The PCR product is obtained by agarose gel electrophoresis, and the ERIC PCR fingerprint of the genomic DNA of Salmonella isolated from fresh meat source is obtained. Gel fingerprint Pro 4 is applied to the fingerprint. The map was analyzed by gel quantitative analysis, and then UPGMA clustering analysis was performed with NTSYS PC. After that, the genotypes of Salmonella isolates were compared with their sampling time and location, and their sources of pollution were traced. This method can trace the source quickly and accurately by ERIC PCR, which makes up for the shortcomings of traditional typing methods. It has the characteristics of simple, high resolution, good reproducibility and low cost, and can be popularized at the grass-roots level.

【技术实现步骤摘要】
鲜肉源沙门氏菌ERIC-PCR溯源方法
本专利技术属于食品安全检测
，尤其涉及一种鲜肉源沙门氏菌ERIC-PCR溯源方法。
技术介绍
沙门氏菌(Salmonella)是一种常见食源菌和重要的人畜共患病原菌。沙门氏菌属于肠杆菌科，是一类呈短杆状，不产芽孢，无荚膜，革兰氏阴性的兼性厌氧菌。除鸡白痢沙门氏菌(S.pullorum)和鸡伤寒沙门氏菌(S.gallinarum)外，其他血清型均有鞭毛，能运动。沙门氏菌广泛存在于自然界中，最适生长温度为37℃，对外界环境抵抗力比较强，在蛋类、畜禽肉类、乳类及其制品中可存活数周至数月。目前，世界上已经发现沙门氏菌约有67个菌群共2600多种血清型(serotypes)和变种(variants)。食用了受污染的食物是人类感染沙门氏菌的主要途经，尤其是畜禽肉类、蛋类、乳类等畜产品，人类约95％的Salmonella感染源于食物污染。沙门氏菌主要引起人和动物的胃肠炎，有时引起败血症以及肠外灶感染等多种症候群；此外，还可引起人类的食物中毒，表现腹痛、腹泻、恶心、呕吐甚至死亡等。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种简便、快速、分辨率高、重现性好且费用低廉的鲜肉源沙门氏菌ERIC-PCR溯源方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：鲜肉源沙门氏菌ERIC-PCR溯源方法，提取鲜肉源同一血清型沙门氏菌分离株基因组DNA作为模板，运用ERIC-PCR技术扩增其序列，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后获得鲜肉源沙门氏菌分离株基因组DNA的ERIC-PCR指纹图谱；应用Gel-ProAnalyzer4.0对ERIC-PCR指纹图谱进行凝胶定量分析，矩阵化后用NTSYS-pc进行UPGMA聚类分析；然后，通过对沙门氏菌分离株的基因分型结果与其采样时间、地点的比较，追溯其污染来源。ERIC-PCR的引物序列为：ERIC1引物序列：5’-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3’，ERIC2引物序列：5’-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’。上述鲜肉源沙门氏菌ERIC-PCR溯源方法，包括以下步骤：(1)采用热裂解法提取沙门氏菌的总DNA作为PCR扩增的模板；(2)取步骤(1)所得模板，采用合成引物ERIC1和ERIC2进行PCR扩增，扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后进行紫外拍照，得沙门氏菌分离株基因组DNA的ERIC-PCR指纹图谱；(为减少误差，所有分离株的ERIC-PCR均在同一反应条件下完成，反应产物加样于同一块琼脂糖凝胶中进行电泳；)(3)记录扩增产物的电泳谱带，应用Gel-ProAnalyzer4.0软件对ERIC-PCR指纹图谱进行凝胶定量分析，获得到各条带的分子量大小，把同样分子量大小的排为同行，得到一个矩阵，按照“有条带的位置记为1，无条带的位置记为0”的方法把矩阵转换成0，1矩阵，再将其导入聚类软件NTSYS-pc进行UPGMA聚类，构建聚类树，进行聚类分析；(4)每个分离株看作是一个分类学单位(operationaltaxonomicunit；OTU)，并把相似性≥90％的菌株看作一个分离株。步骤(1)按以下进行操作：接种环取纯培养的沙门菌一环，放入盛有50μL25mmol·L-1NaOH的EP管中，混匀，于100℃水浴加热10min，然后加入4μL1mol·L-1Tris-HCl，将上述混悬液于12000r·min-1的离心机中离心5min，最后取上清作为PCR扩增的模板。针对鲜肉源沙门氏菌缺乏简便有效溯源方法的问题，专利技术人建立了一种鲜肉源沙门氏菌ERIC-PCR溯源方法，提取鲜肉源同一血清型沙门氏菌分离株基因组DNA作为模板，运用ERIC-PCR技术扩增其序列，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后获得鲜肉源沙门氏菌分离株基因组DNA的ERIC-PCR指纹图谱；应用Gel-ProAnalyzer4.0对ERIC-PCR指纹图谱进行凝胶定量分析，矩阵化后用NTSYS-pc进行UPGMA聚类分析；然后，通过对沙门氏菌分离株的基因分型结果与其采样时间、地点的比较，追溯其污染来源。该法通过ERIC-PCR可对沙门氏菌的污染在血清分型的基础上进行快速准确地溯源，弥补了传统分型方法的不足，具有快速、简便、分辨率高、重现性好、费用低廉的特点，可在基层广泛推广。应用本专利技术可对鲜肉中污染的沙门氏菌进行快速准确地溯源，有效预防和控制沙门氏菌的扩散蔓延，为食品生产链中重要食源菌的危害分析及关键环节控制点(hazardanalysiscriticalcontrolpoint；HACCP)的制定提供参考，对于鲜肉源沙门氏菌的防控具有重要的意义。附图说明图1是基于ERIC-PCR带型的71株鲜肉源S.derby分离株遗传关系聚类树状图。图2是基于ERIC-PCR带型的21株鲜肉源S.agona分离株遗传关系聚类树状图。具体实施方式1.菌株如表1和表2，从市售鲜肉分离到的S.derby分离株71株、S.agona分离株21株。表1供试S.derby菌株及其来源表2供试S.agona菌株及其来源2.方法2.1引物设计所用ERIC-PCR引物见表3，由上海华大生物工程有限公司合成。表3ERIC-PCR的引物及其序列2.2沙门氏菌DNA的提取采用热裂解法提取沙门菌总DNA，具体操作如下：接种环取纯培养的沙门菌一环，放入盛有50μLNaOH(25mmol·L-1)的EP管中，混匀，于100℃水浴加热10min，然后加入4μL的Tris-HCl(1mol·L-1)，将上述混悬液于12000r·min-1的离心机中离心5min，最后取上清作为PCR扩增的模板。2.3ERIC-PCR反应ERIC-PCR反应体系：12.5μL的GreenTaqmix，ERIC1、ERIC2引物(20μM)各0.5μL，2μL的DNA模板，加灭菌超纯水配制成25μL的体系；ERIC-PCR反应程序为94℃预变性5min，然后94℃变性45s，退火54℃1min，72℃延伸5min，变性延伸循环35次，最后72℃终延伸7min。将PCR扩增产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，最终通过凝胶成像系统拍照，得沙门氏菌分离株基因组DNA的ERIC-PCR指纹图谱。2.4ERIC-PCR指纹分析记录扩增产物的电泳谱带。应用Gel-ProAnalyzer4.0软件对以上ERIC-PCR指纹图谱进行凝胶定量分析，得到各条带的分子量大小，把同样分子量大小的排为同行，得到一个矩阵，按照“有条带的位置记为1，无条带的位置记为0”的方法把矩阵转换成0，1矩阵，再将其导入聚类软件NTSYS-pc进行UPGMA聚类，构建聚类树，进行聚类分析。每个分离株看作是一个分类学单位(operationaltaxonomicunit；OTU)，并把相似性≥90％的菌株看作一个分离株。3.结果如图1所示，71株S.derby遗传相似性在74％～100％，共分为6个基因型。其中，菌株59、61均属于同一基因型，为同一分离株，且来自同一时间点、同一超市的不同肉品，说明该超市销售的不同肉品存在同一沙门氏菌的交叉污染；菌株51、52和56、66采自同一地点不同时间点的同一菌株，说明这个销售点可能存在因清洁不彻底而导致的同一S.derby菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鲜肉源沙门氏菌ERIC‑PCR溯源方法，其特征在于：提取鲜肉源同一血清型沙门氏菌分离株基因组DNA作为模板，运用ERIC‑PCR技术扩增其序列，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后获得鲜肉源沙门氏菌分离株基因组DNA的ERIC‑PCR指纹图谱；应用Gel‑Pro Analyzer 4.0对ERIC‑PCR指纹图谱进行凝胶定量分析，矩阵化后用NTSYS‑pc进行UPGMA聚类分析；然后，通过对沙门氏菌分离株的基因分型结果与其采样时间、地点的比较，追溯其污染来源。

【技术特征摘要】
1.一种鲜肉源沙门氏菌ERIC-PCR溯源方法，其特征在于：提取鲜肉源同一血清型沙门氏菌分离株基因组DNA作为模板，运用ERIC-PCR技术扩增其序列，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后获得鲜肉源沙门氏菌分离株基因组DNA的ERIC-PCR指纹图谱；应用Gel-ProAnalyzer4.0对ERIC-PCR指纹图谱进行凝胶定量分析，矩阵化后用NTSYS-pc进行UPGMA聚类分析；然后，通过对沙门氏菌分离株的基因分型结果与其采样时间、地点的比较，追溯其污染来源。2.根据权利要求1所述的鲜肉源沙门氏菌ERIC-PCR溯源方法，其特征在于：所述ERIC-PCR的引物序列为：ERIC1引物序列：5’-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3’，ERIC2引物序列：5’-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’。3.根据权利要求1所述的鲜肉源沙门氏菌ERIC-PCR溯源方法，其特征在于包括以下步骤：(1)采用热裂解法提取沙门氏菌的总DNA作为PCR扩增的模板；(2)取步骤(1)所得模板，采用合成引物ER...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦平，刘书宏，梁竞臻，王培坤，石梦雅，黄腾，磨美兰，韦天超，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西,45