基于数字LAMP技术检测副溶血弧菌的引物及其试剂盒与方法技术

本发明专利技术公开了一种基于数字LAMP技术检测副溶血弧菌的引物及其试剂盒与方法。试剂盒包括:2×ddLAMP Supermix、引物组合、无RNA酶的超纯水、细菌总DNA提取试剂、阴性对照和阳性对照。其检测方法是通过提取待检样品DNA，配置LAMP反应体系，进行微滴化和LAMP反应后，通过检测荧光信号，判断待检样品是否含有副溶血弧菌，并测定其含量。本发明专利技术具有快速、精准、灵敏、适用性广，无需依赖变温扩增设备，可实现绝对定量等优点，为海产品中的副溶血弧菌快速准确检测提供有效分析手段。

Primers, Kits and Methods for Detecting Vibrio parahaemolyticus Based on Digital LAMP Technology

The invention discloses a primer, a kit and a method for detecting Vibrio parahaemolyticus based on digital LAMP technology. The kit included: 2 x ddLAMP Supermix, primer combination, super pure water without RNA enzyme, total bacterial DNA extraction reagent, negative control and positive control. The detection method is to extract DNA from the sample to be examined, configure the LAMP reaction system, microtitration and LAMP reaction, and detect the fluorescence signal to determine whether the sample contains Vibrio parahaemolyticus, and determine the content of Vibrio parahaemolyticus. The method has the advantages of fast, accurate, sensitive, wide applicability, no need to rely on temperature-changing amplification equipment, absolute quantification and so on, and provides an effective analysis means for rapid and accurate detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood.

【技术实现步骤摘要】
基于数字LAMP技术检测副溶血弧菌的引物及其试剂盒与方法
本专利技术涉及一种副溶血弧菌测试装备，具体涉及一种基于数字LAMP技术检测副溶血弧菌的试剂盒，属于分子生物学

技术介绍
副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一种重要的食源性致病菌。该菌主要栖息于近海海洋和河口环境，在双壳贝类、虾、海鱼等海产品中可被大量检出，是引起沿海地区食物中毒的首要病因。随着海产品销售量日益增加，建立一种快速定量检测副溶血弧菌的方法，对海产品的质量检测和人类的健康至关重要。目前，实验室常用的检测副溶血弧菌的方法有传统方法(细菌分离)和分子生物学检测技术(常规PCR，实时荧光定量PCR和环介导等温扩增技术等)。传统的细菌分离检测方法，存在耗时长、操作复杂等诸多不足。PCR操作复杂，需进行跑胶分析，并且灵敏度低；实时荧光PCR需使用昂贵的仪器设备并依赖标准曲线进行定量检测，灵敏度仍存在一定的局限性；环介导等温扩增技术由于引物间的非特异性扩增而易产生假阳性结果。数字环介导等温扩增技术(digitalloop-mediatedisothermalamplification,dLAMP)是基于第三代数字PCR技术原理，将预混的LAMP体系进行微滴化处理，形成几万至几十万个油包水的液化微滴中，保证每个微滴中含有一个或不含有核酸模板，经过LAMP扩增后，经过荧光检测每个微滴中的阳性微滴数和阴性微滴数，根据泊松分布原理即可计算出核酸模板的初始拷贝数。该方法具有以下优点：①特异性强：针对靶基因的不同区域设计多对特异引物，不会受到反应混合物中存在的其他非靶序列的影响，同时可根据熔解曲线鉴别非特异性扩增；②灵敏性高:dLAMP检测的是荧光信号，能检测到普通PCR的1/10-1/100的拷贝数；③恒温：该技术反应体系只需在恒定温度下就能扩增反应，不需要预先进行双链的变性；④快速：LAMP反应在15-60min即可完成；⑤设备简单：不需要特殊的变温设备。为了解决上述传统方法检测副溶血弧菌面临的问题，迫切需要开发一种快速、高效、低成本的检测技术。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种数字LAMP技术检测副溶血弧菌的试剂盒，能够应用于海产品中副溶血弧菌的快速、精准检测。本专利技术的第一个技术目的是提供用于检测副溶血弧菌的特异性引物，其核苷酸序列分别：外引物F3：AGAACTTCATGTTGATGACACT(SEQIDNO：1)；外引物B3：CGGTGAGTTGCTGTTGT(SEQIDNO：2)；内引物FIP：ACATCGCTTGTGCCTTGATGAACTCAACACAAGAAGAGATCG(SEQIDNO：3)；内引物BIP：GCCTTGTTCGAGACGCTAACTCGACAGACGATGAGCG(SEQIDNO：4)；环引物LF：ACTCGTTCATCTCAAGCACTT(SEQIDNO：5)；环引物LB：GCCAGAAGAGCACGGTT(SEQIDNO：6)；优选地，扩增反应时，内引物FIP和BIP，环引物LF和LB，与外引物F3和B3的摩尔比为8：4：1。本专利技术提供了上述的特异性引物在制备副溶血弧菌检测试剂盒或检测试剂中的应用。本专利技术提供了一种含有上述特异性引物的试剂盒。所述试剂盒优选为微滴数字LAMP绝对定量检测试剂盒。本专利技术的另一技术目的在于提供一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度和精确度的、操作简单的检测副溶血弧菌的微滴数字LAMP绝对定量检测试剂盒，其特征在于，试剂盒包含权利要求1中所述的引物。优选地，基于数字LAMP技术检测副溶血弧菌的试剂盒还包括以下成分的部分或者全部：(1)2×ddLAMPSupermix；(2)无RNA酶的蒸馏水；(3)阳性对照和阴性对照；(4)细菌总DNA提取试剂。优选地，内引物FIP和BIP各160μmol/L，外引物F3和B3各80μmol/L，环引物LF和LB各160μmol/L，1×TE，50mmol/LTris-HCl(pH8.8)，250mmol/LKCl，200mmol/LMgSO4，250mmol/L(NH4)2SO4，2.8％Tween-20，7.14mol/L甜菜碱，10mmol/LdNTP，Bst大片断DNA聚合酶160U，20×EvaGreen，RNaseCocktail。优选地，阳性对照为副溶血弧菌DNA，阴性对照为超纯水。优选地，细菌总DNA提取试剂包括裂解液A、洗液B、洗液C、洗脱液D、吸附柱和收集管。再有，本专利技术还公开了一种基于数字LAMP技术检测副溶血弧菌的方法，包括如下步骤：(1)细菌总DNA的提取1)取待检样品1g，加入600μL裂解液A研磨后，涡旋混匀20s，室温静置10min；2)将混合液移至吸附柱中，12,000×g离心30～60s；3)丢弃收集管中液体，加入500μL洗液B至吸附柱中，12,000×g离心30～60s；4)丢弃收集管中液体，加入500μL洗液C至吸附柱中，12,000×g离心30～60s；5)丢弃收集管中液体，12,000×g离心2min以甩干柱子；6)将吸附柱移入新的1.5mL离心管中，向柱子中央加入洗脱液50μL，室温静置2min，12,000×g离心1min，离心管中液体即为模板DNA；(2)数字LAMP操作1)待检样品、阴性对照和阳性对照每个反应管各加入数字LAMP反应液19μL；分别取1μL模板DNA，加入相应的反应管中，配置成20μL数字LAMP反应体系；所述模板DNA包括待检样品、阴性对照和阳性对照；2)将20μL样品反应液加入到微滴发生卡内，制备微滴；3)将微滴转入PCR板中，放入水浴锅或PCR仪中进行扩增；4)将扩增完成的PCR板放入微滴分析仪中，检测微滴中的荧光信号，分析数据，显示检测结果；5)结果判定及描述：阳性对照：20±2个拷贝，阴性对照：＜1个拷贝时，实验结果成立；待检测样品结果≥1个拷贝时为阳性；待检测样品结果＜1个拷贝时为阴性。优选地，数字LAMP反应体系为20μL反应体系，其含有2×ddLAMPSupermix10μL，超纯水9μL，加入1μL模板后为20μL。优选地，扩增程序为：63℃反应35min，并在80℃持续2min。本专利技术以LAMP和数字PCR微滴生成系统及检测系统为依托，开发数字LAMP技术绝对定量检测副溶血弧菌的试剂盒及检测方法。目前尚未有将微滴数字LAMP技术应用于检测副溶血弧菌的试剂盒。本试剂盒能够在短时间内实现副溶血弧菌的快速、精准定量，为海产品中副溶血弧菌的检测提供有力的技术支持，有着广阔的应用前景和产业化前景。因此，相比于现有的其他检测技术，本专利技术技术具有快速、精准、灵敏、适用性广、操作简单等优点：①特异性强：针对靶基因的不同区域设计多对特异引物，不会受到反应混合物中存在的其它非靶序列的影响，同时可根据熔解曲线鉴别非特异性扩增；②灵敏性高:dLAMP检测的是荧光信号，能检测到普通PCR的1/10-1/100的拷贝数；③恒温：该技术反应体系只需在恒定温度下就能扩增反应，不需要预先进行双链的变性；④快速：LAMP反应在15-60min即可完成；⑤设备简单：不需要特殊的变温设备。附图说明图1是本专利技术实施例3中特异性实验的检测结果图。图1中，1：阳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于数字LAMP技术检测副溶血弧菌的引物，包括内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，环引物LF和LB，其核苷酸序列分别如下所示：外引物F3：AGAACTTCATGTTGATGACACT外引物B3：CGGTGAGTTGCTGTTGT内引物FIP：ACATCGCTTGTGCCTTGATGAACTCAACACAAGAAGAGATCG内引物BIP：GCCTTGTTCGAGACGCTAACTCGACAGACGATGAGCG环引物LF：ACTCGTTCATCTCAAGCACTT环引物LB：GCCAGAAGAGCACGGTT。

【技术特征摘要】
1.一种基于数字LAMP技术检测副溶血弧菌的引物，包括内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，环引物LF和LB，其核苷酸序列分别如下所示：外引物F3：AGAACTTCATGTTGATGACACT外引物B3：CGGTGAGTTGCTGTTGT内引物FIP：ACATCGCTTGTGCCTTGATGAACTCAACACAAGAAGAGATCG内引物BIP：GCCTTGTTCGAGACGCTAACTCGACAGACGATGAGCG环引物LF：ACTCGTTCATCTCAAGCACTT环引物LB：GCCAGAAGAGCACGGTT。2.如权利要求1所述的基于数字LAMP技术检测副溶血弧菌的引物，其特征在于：扩增反应时，内引物FIP和BIP，环引物LF和LB和外引物F3和B3的摩尔比为8：4：1。3.一种基于数字LAMP技术检测副溶血弧菌的试剂盒，其特征在于，试剂盒包含权利要求1或2中所述的引物。4.如权利要求3所述的基于数字LAMP技术检测副溶血弧菌的试剂盒，其特征在于，还包括以下成分的部分或者全部：(1)2×ddLAMPSupermix；(2)无RNA酶的超纯水；(3)阳性对照和阴性对照；(4)细菌总DNA提取试剂。5.如权利要求4所述的基于数字LAMP技术检测副溶血弧菌的试剂盒，其特征在于：所述2×ddLAMPSupermix包含以下试剂：内引物FIP和BIP各160μmol/L，外引物F3和B3各80μmol/L，环引物LF和LB各160μmol/L，1×TE，50mmol/LTris-HCl(pH8.8)，250mmol/LKCl，200mmol/LMgSO4，250mmol/L(NH4)2SO4，2.8％Tween-20，7.14mol/L甜菜碱，10mmol/LdNTP，Bst大片断DNA聚合酶160U，20×EvaGreen，RNaseCocktail。6.如权利要求4所述的基于数字LAMP技术检测副溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：李丽丽，孟赫诚，温雯，石磊，刘雨琦，
申请(专利权)人：暨南大学，华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44