细胞的制备方法技术

本发明专利技术将提供制备体细胞的方法，其包括将哺乳动物的已分化的体细胞在用于诱导分化除了上述已分化的体细胞以外的其它体细胞的培养基中，在TGF‑β通路抑制剂的存在下进行培养，从而使上述已分化的体细胞转换为其它体细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】细胞的制备方法
相关申请的交叉引用本申请基于2015年10月21日提出申请的日本专利申请第2015-207529号说明书要求优先权，并将其公开的全体通过参考援引于本说明书中。本专利技术主要涉及细胞的制备方法。具体而言，涉及一种基于直接重编程的细胞的制备方法。本专利技术还涉及用于使已分化的体细胞转换为其它体细胞的诱导剂。
技术介绍
近年来着眼于再生医疗技术，其通过将细胞移植给患者而对功能、形态的异常进行补充以治疗疾病。例如对成骨细胞而言，如果以修复骨肿瘤、外伤、骨髓炎等导致的骨缺损、以及骨肿瘤等刮治后的骨缺损的修复目的，而向病变部移植成骨细胞，则可以期待促进骨形成，提高功能、形态性的预后。实际上，例如已经进行了将从患者的松质骨(cancellousbone)收集的骨髓细胞进行自体移植的治疗，其有效性已知。在该情况下，认为从自体骨髓细胞中包含的间充质干细胞诱导分化了成骨细胞，促进了骨形成和重建。另一方面，随着老龄化，骨质疏松症的罹患率增加，也存在老人如果骨折则导致长期卧床的情况。认为成骨细胞的移植可以促进治愈骨质疏松症、外伤等导致的骨折、难治性骨折、假骨折(pseudofracture)。成骨细胞的移植也可能对以下方面有效：类风湿性关节炎、突发性股骨头坏死、变形性关节症、腰椎峡部畸形症(lumbarspondylosisdeformans)、椎管狭窄症、椎间盘突出症、峡部裂(spondylolysis)、脊椎松解型滑脱症、脊柱侧弯症、脊髄型颈椎病、后纵韧带骨化症、脊髓损伤、变形性髋关节症(coxarthrosis)、变形性膝关节症(gonarthrosis)、股骨头滑脱症、骨软化症、手术后的骨的修复(心脏手术之后的胸骨的修复等)、人工踝关节手术所伴随的缺陷部的修复、骨髓炎、骨坏死(osteonecrosis)等。另一方面，牙周病也被称为第4生活方式病，罹患率极高，还构成了各种全身性疾病的原因。随着牙周病的进行而发生牙槽骨的骨吸收，所以认为如果将成骨细胞效率良好地供应到局部的骨吸收部，则与牙槽骨的再生治疗相关。另外，如果将成骨细胞的移植与骨移植、人工骨移植、人工关节、植入进行组合使用，则有提高治疗效果的可能性。在再生医疗技术中，使用的细胞的供应方式是待解决的问题之一。例如，作为移植目的的成骨细胞，迄今为止已使用了骨髓间充质干细胞、包含骨髓间充质干细胞的骨髓细胞等。但是，采集骨髓对患者的侵害较大，并存在不能供应足够数量的骨髓细胞的情况等问题。另一方面，如果使用人胚胎干细胞(ES细胞)，则不需要从患者采集骨髓，也有能够供应足够数量的成骨细胞的可能性，但有伦理问题，除此以外，存在移植后残存的ES细胞发生肿瘤化的危险性。另外，即使使用了iPS细胞，虽然不再需要从患者收集骨髓，并有能够供应足够数量的成骨细胞的可能性，但存在移植后残存的iPS细胞发生肿瘤化的危险性。对于其它细胞也存在同样的问题。在非专利文献1中进行了对人ES细胞的Osterix的慢病毒载体导入+利用成骨性(Osteogenic)培养基的向成骨细胞的诱导分化。在非专利文献2、3中，从小鼠iPS细胞经历MSC而利用成骨性培养基进行诱导分化，得到了成骨细胞。在非专利文献4中，向小鼠iPS细胞导入Runx2的腺病毒载体，利用成骨性培养基进行诱导分化，得到了成骨细胞。如非专利文献1～4所示那样，成骨细胞是从ES细胞、iPS细胞等多功能性干细胞进行诱导分化而制成的，因此需要长期的培养，也存在癌变的危险性。对于向体细胞导入组织特异性的转录因子的基因群，可以直接诱导分化(不经历iPS细胞的转化)为该组织细胞(直接转换(直接重编程))，例如有以下报告：小鼠成纤维细胞→软骨细胞(导入SOX9+Klf4+c-Myc基因)小鼠成纤维细胞→心肌细胞(导入GATA4+Mef2c+Tbx5基因)小鼠成纤维细胞→肝细胞(导入Hnf4α+(Foxa1或Foxa2或Foxa3)基因)小鼠成纤维细胞→神经干细胞(导入Sox2+FoxG1基因等)、小鼠、人细胞→造血干细胞等。专利文献1公开了用于向体细胞导入指定的基因群而有效地制备(直接转换)有功能性的成骨细胞的方法。然而，在导入基因的方法中，由于导入的基因、载体的影响，存在细胞发生肿瘤化的可能性。另外也存在需要用于证实安全性的费用和时间等问题。因此，需要不导入基因而诱导为移植用的细胞的技术现有技术文献专利文献专利文献1：国际公开公报WO2015/012377非专利文献非专利文献1：KarnerE等人.JCellPhysiol.2009.非专利文献2：LiF等人.JCellBiochem.2010.非专利文献3：BiloussovaG等人.Stemcells.2011.非专利文献4：TashiroK等人.Stemcells.2009.
技术实现思路
专利技术要解决的问题本专利技术主要的目的在于提供细胞的制备方法，特别是将已分化的体细胞不进行基因导入而转换为其它体细胞的技术(直接转换(直接重编程))的技术)。解决问题的方法本专利技术人发现：通过将哺乳动物的已分化的体细胞在培养基中，在TGF-β通路抑制剂的存在下在各种组成的培养基中进行培养，可以将原材料的体细胞转换为除了该原材料的体细胞以外的其它体细胞。尚没有使用TGF-β通路抑制剂的直接转换(直接重编程)的报告。本专利技术包括以下的成骨细胞的制备方法、成骨细胞的诱导剂及试剂盒。项1，制备体细胞的方法，其包括将哺乳动物的已分化的体细胞在用于诱导分化除了上述已分化的体细胞以外的其它体细胞的培养基中，在TGF-β通路抑制剂的存在下进行培养，使上述已分化的体细胞转换为其它体细胞。项2，根据项1所述的方法，其中，TGF-β通路抑制剂为TGF-β/SMAD通路抑制剂。项3，根据项1或2所述的方法，其中，TGF-β通路抑制剂为D4476、SB431542、LY2157299、SD208或ALK5抑制剂II。项4，根据项1～4中任一项所述的方法，其中，TGF-β通路抑制剂为ALK5抑制剂II。项5，根据项1～4中任一项所述的方法，其中，使成纤维细胞转换为间充质类的细胞。项6，根据项1～4中任一项所述的方法，其中，使成纤维细胞或角质细胞转换为成骨细胞。项7，根据项1～4中任一项所述的方法，其中，使成纤维细胞或外周血单核细胞转换为白色脂肪细胞。项8，根据项1～4中任一项所述的方法，其中，使成纤维细胞或角质细胞转换为棕色脂肪细胞。项9，根据项7或8所述的方法，其中，用于诱导分化体细胞的培养基包含过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)激动剂。项10，根据项1～4中任一项所述的方法，其中，使成纤维细胞转换为软骨细胞。项11，根据项1～4的任一项所述的方法，其中，使成纤维细胞转换为成肌细胞。项12，根据项1～4中任一项所述的方法，其中，使成纤维细胞转换为施万细胞。项13，根据项1～4中任一项所述的方法，其中，使角质细胞转换为尿路上皮细胞。项14，根据项1～4中任一项所述的方法，其中，使成纤维细胞转换为间充质干细胞。项15，用于使已分化的体细胞转换为其它体细胞的诱导剂，其包含TGF-β通路抑制剂。项16，用于使已分化的体细胞转换为其它体细胞的试剂盒，所述试剂盒包括TGF-β通路抑制剂及用于诱导分化上述其它体细胞的培养基。专利技术的效本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.制备体细胞的方法，其包括将哺乳动物的已分化的体细胞在用于诱导分化除了所述已分化的体细胞以外的其它体细胞的培养基中，在TGF‑β通路抑制剂的存在下进行培养，使所述已分化的体细胞转换为其它体细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.21 JP 2015-2075291.制备体细胞的方法，其包括将哺乳动物的已分化的体细胞在用于诱导分化除了所述已分化的体细胞以外的其它体细胞的培养基中，在TGF-β通路抑制剂的存在下进行培养，使所述已分化的体细胞转换为其它体细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其中，TGF-β通路抑制剂为D4476、SB431542、LY2157299、SD208或ALK5抑制剂II。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，TGF-β通路抑制剂为ALK5抑制剂II。4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，使成纤维细胞转换为间充质类的细胞。5.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，使成纤维细胞或角质细胞转换为成骨细胞。6.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，使成纤维细胞或外周血单核细胞转换为白色脂肪细胞。7.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：山本健太，岸田纲郎，素轮善弘，山本俊郎，松田修，
申请(专利权)人：京都府公立大学法人，
类型：发明
国别省市：日本,JP