人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的保存方法技术

将人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞在维持高生存率的同时进行保存，且在保存后的培养中将杂质细胞的发生比例抑制得小。一种人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的保存方法，其特征在于，在满足以下所列举的(a)

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的保存方法


[0001]本专利技术涉及可以通过在保存后再次培养而分化成熟、表达人角膜内皮细胞功能特性的人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的保存方法。

技术介绍

[0002]作为体外培养人角膜内皮细胞的方法，如专利文献1、非专利文献1以及非专利文献2所示，已知有给予表皮生长因子(EGF)并进一步给予其它因子从而进行培养的方法，所述其它因子抑制因给予EGF而对人角膜内皮细胞的成熟、分化带来的不良影响。
[0003]对此，如专利文献2及专利文献3所示，本专利技术人等开发了尽可能不给予表皮生长因子(EGF)而培养人角膜内皮细胞的方法。与专利文献1、非专利文献1以及非专利文献2记载的培养方法相比，根据该专利文献2或专利文献3记载的培养方法，能够尽可能抑制不具有人角膜内皮功能特性的杂质细胞(夾雑細胞)的产生，得到与存在于人体内的角膜内皮细胞具有同等角膜内皮功能特性的功能性人角膜内皮细胞(以下也称为效应细胞)的含有率提高的细胞群。
[0004]但是，还没有建立将通过专利文献2或专利文献3记载的方法培养的细胞群或该细胞群中含有的功能性人角膜内皮细胞以悬浮状态进行保存的方法。现有技术文献专利文献
[0005]专利文献1：国际公开2017/110094号公报专利文献2：国际公开2009/028631号公报专利文献3：日本特愿2020
‑
032139非专利文献
[0006]非专利文献1：Vianna L.M.M.,et al.(2016)Arg Bras Oftalmol.；79(1):37非专利文献2：Okumura N.,et al.(2019)PLos ONE 14(6):e0218431

技术实现思路

专利技术要解决的技术问题
[0007]通过所述专利文献2或专利文献3记载的方法培养的细胞群或该细胞群中含有的功能性人角膜内皮细胞作为再生医疗等产品在国际上供给时，希望所述细胞群或所述功能性人角膜内皮细胞可以在悬浮状态下至少保存数日，而不是单层培养的状态。因此，本专利技术人研究了将通过专利文献2或专利文献3记载的方法培养的细胞群或功能性人角膜内皮细胞在悬浮状态下至少保存数日的方法。此外，冷冻保存对于细胞数年以上的长期保存、细胞的库化(
バンク
化)有益，还对冷冻保存功能性人角膜内皮细胞的方法的建立进行了研究。
[0008]通过专利文献2或专利文献3记载的方法，为了使人角膜内皮细胞增殖，成熟分化到成为功能性人角膜内皮细胞的含有率(以下也称为E
‑
ratio)高于90％的细胞群，需要培
养4周
‑
5周以上。因此，首先尝试收集通过专利文献2或专利文献3记载的方法培养4周以上的使其成熟分化到成为功能性人角膜内皮细胞的含有率高于90％的细胞群的细胞群，使其成为悬浮状态进行保存。结果得知，若将使其成熟分化到成为功能性人角膜内皮细胞的含有率高于90％的细胞群后的细胞群在悬浮状态下保存，则保存后的生存率低，在保存后的培养中杂质细胞的发生比例变高。
[0009]根据该结果，本专利技术人进行了关于将人功能性角膜内皮细胞(通过专利文献2或专利文献3记载的方法培养的细胞)在有利地维持高生存率的同时以悬浮状态保存且抑制杂质细胞的产生的方法的开发。其结果，本专利技术人发现，只要在确定分化为功能性人角膜内皮细胞的命运后即刻且在增殖力高的时期收集细胞群使其成为悬浮状态，就可以在维持高生存率的同时进行保存，且在保存后的培养中将杂质细胞的发生比例抑制得小，建立了人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的新颖和改进的保存方法(及其所用的相关组合物)。另外，本专利技术人认为，如果可以在确定分化为功能性人角膜内皮细胞的命运后即刻且在增殖力高的时期收集、保存细胞群，则通过在同一时期收集细胞、重复传代培养，能够在和以往相比非常短的期间内进行功能性人角膜内皮细胞的扩大培养，还建立了功能性人角膜内皮细胞的扩大培养方法。这样，本专利技术人发现并首次完成了如下内容：在本专利技术中，只要是通过在适当培养条件下培养而注定成为功能性人角膜内皮细胞的细胞，通过在未成熟的状态下将该细胞收集并保存或传代，可以得到具有生存率提高及杂质细胞减少的目标性质的功能性人角膜内皮细胞。解决技术问题的技术手段
[0010]即，本专利技术所涉及的人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的保存方法如下。[项目1]一种人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的保存方法，其特征在于，在满足以下所列举的(a)
‑
(d)中的任一个或多个条件的时期，对使用含有ROCK抑制剂且表皮生长因子(EGF)为非添加或EGF的含量小于引起转化(形質転換)的浓度的培养基使其增殖的人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞进行收集，使其成为悬浮状态并进行保存：(a)所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞的形态从具有不规则细长突起的纺锤状成纤维细胞样的形态转变为包含所述突起的长短径比接近1(例如约2:1
‑
约1:2)的铺路石状(例如多边形或圆形)的形态后即刻直到细胞间的边界即将变得不清楚前的期间；(b)从CD44的表达量成为最近的传代后所观察到的最大值的一半以下时直到达到平台的期间；(c)所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞的细胞密度为约900个细胞/mm2以上约2500个细胞/mm2以下；(d)从接种开始的培养天数为约4天以上约14天以下。[项目2]如[项目1]所述的保存方法，其中，在约10℃以下保存所述人角膜内皮细
胞和/或所述人角膜内皮前体细胞。[项目3]如[项目1]或[项目2]所述的保存方法，其中，在约
‑
30℃以下保存所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞。[项目4]如[项目1]‑
[项目3]中任一项所述的保存方法，其中，在使所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞成为悬浮状态后保存约24小时以上。[项目5]如[项目1]‑
[项目4]中任一项所述的保存方法，其中，所述转化包括内皮间质转化。[项目6]如[项目1]‑
[项目5]中任一项所述的保存方法，其中，所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞是以选自于由角膜内皮细胞由来的细胞、多能干细胞、间充质干细胞、从角膜内皮收集的角膜内皮前体细胞、从角膜内皮收集的细胞以及由直接编程法制作的角膜内皮前体细胞和角膜内皮样细胞所组成的组的细胞作为起源而制作的细胞。[项目7]如[项目1]‑
[项目6]中任一项所述的保存方法，其中，使用含有ROCK抑制剂且表皮生长因子(EGF)的含量小于引起转化的浓度的培养基使保存后的所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞增殖和/或分化、成熟所得的人角膜内皮细胞的细胞群满足以下(1)
‑
(8)中的一个或多个项目：(1)在通过相位差成像进行的外观检查中，没有成纤维细胞、异物、变色或其它异常；(2)细胞生存率在台盼蓝染色中为70％以上；(3)细胞上清在通过ELISA进行的纯度试验中PDGF
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的保存方法，其特征在于，在满足以下所列举的(a)
‑
(d)中的任一个或多个条件的时期，对使用含有ROCK抑制剂且表皮生长因子(EGF)的含量小于引起转化的浓度的培养基使其增殖的人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞进行收集，使其成为悬浮状态并进行保存：(a)所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞的形态从纺锤状的形态转变为长径短径的比接近1的多边形或圆形的形态后即刻直到细胞间的边界即将变得不清楚前的期间；(b)从CD44的表达量成为最近的传代后所观察到的最大值的一半以下时直到达到平台的期间；(c)所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞的细胞密度为900个细胞/mm2以上2500个细胞/mm2以下；(d)从最近的传代开始的培养天数为4天以上14天以下。2.如权利要求1所述的保存方法，其中，在10℃以下保存所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞。3.如权利要求1所述的保存方法，其中，在
‑
30℃以下保存所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞。4.如权利要求1
‑
3中任一项所述的保存方法，其中，在使所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞成为悬浮状态后保存24小时以上。5.如权利要求1
‑
4中任一项所述的保存方法，其中，所述转化包括内皮间质转化。6.如权利要求1
‑
5中任一项所述的保存方法，其中，所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞是以选自于由角膜内皮细胞由来的细胞、多能干细胞、间充质干细胞、从角膜内皮收集的角膜内皮前体细胞、从角膜内皮收集的细胞以及由直接编程法制作的角膜内皮前体细胞和角膜内皮样细胞所组成的组的细胞作为起源而制作的细胞。7.如权利要求1
‑
6中任一项所述的保存方法，其中，使用含有ROCK抑制剂且表皮生长因子(EGF)的含量小于引起转化的浓度的培养基使保存后的所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞增殖和/或分化、成熟所得的人角膜内皮细胞的细胞群满足以下(1)
‑
(8)中的一个或多个项目：(1)在通过相位差成像进行的外观检查中，没有成纤维细胞、异物、变色或其它异常；(2)细胞生存率在台盼蓝染色中为70％以上；(3)细胞上清在通过ELISA进行的纯度试验中PDGF
‑
BB为100pg/mL以上；(4)细胞在通过FACS进行的纯度试验结果中满足以下所有范围：CD166
+
>99％CD24
+
<5％CD44
high
<5％CD44
neg
‑
low
>90％CD90
+
<5％；
以上2500个细胞/mm2以下；(d)从最近的传代开始的培养天数为4天以上14天以下。17.一种人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的培养方法，其特征在于，在满足以下所列举的(a)
‑
(d)中的任一个或多个条件的时期，对使用含有ROCK抑制剂且表皮生长因子(EGF)的含量小于引起转化的浓度的培养基使其增殖的人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞进行收集、传代：(a)所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞的形态从具有不规则细长突起的纺锤状成纤维细胞样的形态转变为长径短径的比接近1的铺路石状的形态后即刻直到细胞间的边界即将变得不清楚前的期间；(b)从CD44的表达量成为最近的传代后所观察到的最大值的一半以下时直到达到平台的期间；(c)所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞的细胞密度为900个细胞/mm2以上2500个细胞/mm2以下；(d)从最近的传代开始的培养天数为4天以上14天以下。18.一种保存方法，所述保存方法是保存经培养的人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的方法，所述保存方法具备：得到多个人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的工序；分离所述多个细胞的至少一部分，生成用于评价的细胞群和用于保存的细胞群的工序；对所述细胞群的至少一部分进行关于以下(a)、(b)、(c)和(d)的评价基准中的一个以上的评价的工序：(a)确定人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的形态从纺锤形变化为(i)多边形或(ii)长轴与短轴的比接近1的椭圆形的任一者且细胞间的边界清楚的细胞，(b)确定在CD44的表达量为最近的传代后所观察到的最大值的一半以下的水平下使CD44表达后，表达一定量的CD44的细胞，(c)识别人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的细胞密度为900个/mm2以上2500个/mm2以下，以及，(d)确定从所述评价开始直到最近的传代为止的期间是否为4天以上14天以下；以及在用于评价的细胞群满足所述(a)、(b)、(c)和(d)中的任一个的评价基准的一个以上的情况下，从细胞群中将至少一部分细胞配置在保存介质中以用于进行保存的工序。19...

【专利技术属性】
技术研发人员：木下茂，户田宗丰，外园千惠，上野盛夫，
申请(专利权)人：京都府公立大学法人，
类型：发明
国别省市：