人功能性角膜内皮细胞及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种用于特定培养人角膜内皮细胞的细胞性状的检定技术，所述培养人角膜内皮细胞在临床试验中已被确认到早期临床效果发生及长期稳定的临床效果。本发明专利技术提供一种制造人功能性角膜内皮细胞的方法，所述人功能性角膜内皮细胞在向人的眼前房内注入时能引发人角膜功能，该方法包括使角膜内皮前体细胞在能将增殖应激等培养应激极小化的培养条件下增殖和/或分化

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】人功能性角膜内皮细胞及其应用


[0001]本专利技术涉及在向人的眼前房内注入时能引发人角膜内皮功能特性的人功能性角膜内皮细胞、包含该细胞的药物、该细胞的制造法等。

技术介绍

[0002]针对以水疱性角膜症为代表的角膜内皮障碍的现在的治疗法只有使用供体角膜的角膜移植术，但该手术的长期临床结果不充分。另外，关于角膜移植后的视力，因诱导角膜不规则散光而在患者的满意度方面也不充分。角膜移植患者的约60％以上为水疱性角膜症、包括早期富克斯角膜营养不良的角膜内皮功能不全。水疱性角膜症的主要原因为因白内障手术、青光眼手术、玻璃体视网膜手术或激光虹膜切除术等眼科手术引起的角膜内皮障碍、角膜外伤、假性表皮剥脱综合征及富克斯角膜内皮营养不良。据报道，欧美的具有富克斯角膜内皮营养不良的遗传倾向性的潜伏患病率为约5％以上。在角膜移植术中，需要1个眼睛的供体角膜来治疗一个病理性眼睛，不构成解决持续性的供体不足的手段。鉴于全世界存在很多潜伏患者，作为非常重要的课题，全世界强烈希望提供一种革新的医疗，其与角膜移植技术相比具有能够适用于广泛的医疗机关中的通用性和简便性。而且，细胞注入疗法会带来角膜的正常形状而不会产生伴随角膜移植的变形，其结果，能够实现长期良好的视觉功能恢复。

技术实现思路

[0003]用于解决课题的技术手段
[0004]本专利技术的专利技术人们在世界上首次发现培养人角膜内皮细胞因培养中的细胞相变(纤维化、上皮间质转化、内皮间质转化、老化、脱分化等)而夹杂与健康的角膜内皮组织所保持的角膜内皮细胞性状不同的细胞亚群，通过设计选择性地增殖培养中的亚群的技术，确认了特定亚群、即具有充分的成熟分化人角膜内皮细胞功能的功能性细胞(也称为效应(effector)细胞。)形成最适于细胞注入疗法的小型且六边形类卵石形状，并且具有与健康的角膜内皮组织所保持的角膜内皮细胞类似的性状。
[0005]在本专利技术中，针对用于特定培养人角膜内皮细胞(其在临床试验中确认到早期临床效果发生及长期稳定的临床效果)的细胞性状的检定技术进行了深入研究，并且在世界上首次实现了该技术的专利技术。基于新专利技术创造出的技术，完成了用于特定、提供培养人角膜内皮细胞(其通过利用各种代谢相关酶规定线粒体功能，从而确保早期临床效果发生及长期稳定的临床效果)的专利技术。
[0006]本专利技术在世界上首次提供一种对患者友好的划时代的医疗，其通过能够稳定生产(是用于在任何时间提供相同医疗的绝对要件)、并且能够广泛适用于全世界的成本非常低廉的制法，长期重建均质且小型的移植后高细胞密度角膜内皮组织。其是线粒体依赖性氧化的呼吸亢进的培养人角膜内皮细胞。表明其在角膜移植中对于引起排斥应答的患者也是有效的。
[0007]另外，在本专利技术的制造法中，通过革新性的专利技术(即，通过避免表观遗传性(Epigenetic)的多基因的活化、例如在细胞质、核中发挥作用的基于与TCA代谢路径有关的酶得到的代谢产物、特别是基于乙酰辅酶A(AcCoA)进行的组蛋白的乙酰化等，从而代谢重编程向线粒体功能的保持倾斜而不引起培养细胞的相变)，提供使上述的夹杂亚群细胞的生成极小化、对于广泛改善角膜内皮功能不全患者的角膜混浊、水肿长期有用的高功能内皮细胞。
[0008]因此，本专利技术提供以下内容。
[0009](项目1)一种方法，其是制造在向人的眼前房内注入时能引发人角膜功能的人功能性角膜内皮细胞的方法，
[0010]所述方法包括：(b)使角膜内皮前体细胞在能将增殖应激等培养应激极小化的培养条件下增殖和/或分化
·
成熟的工序。
[0011](项目2)根据(项目1)所述的方法，其中，上述人角膜功能包括角膜内皮细胞功能特性。
[0012](项目3)根据(项目1)或(项目2)所述的方法，其中，所述方法还包括：(a)使来自人角膜内皮组织的细胞脱分化而得到上述角膜内皮前体细胞的工序。
[0013](项目4)根据(项目1)～(项目3)中任一项所述的方法，其是制造在向人的眼前房内注入时能引发人角膜功能、特别是角膜内皮细胞功能特性的功能性人角膜内皮细胞的方法，所述方法使人角膜内皮前体细胞在细胞生长因子的存在下增殖和/或分化
·
成熟，所述细胞生长因子的量低于发生转化的量。
[0014](项目5)根据(项目1)～(项目4)中任一项所述的方法，其中，上述细胞生长因子包括上皮生长因子(EGF)。
[0015](项目6)根据(项目1)～(项目5)中任一项所述的方法，其中，上述转化包括内皮
‑
间充质转化。
[0016](项目7)根据(项目1)～(项目6)中任一项所述的方法，其中，上述增殖和/或分化
·
成熟的工序在ROCK抑制剂的存在下进行。
[0017](项目8)根据(项目1)～(项目6)中任一项所述的方法，其中，所述方法包括确认如下内容的工序：(b)中所得的细胞为在线粒体中线粒体依赖性氧化的磷酸化增加、在细胞质
·
核内的乙酰CoA的表达不增加、并且不引发表观遗传性多基因表达的细胞，所述表观遗传性多基因表达由通过乙酰CoA进行的组蛋白乙酰化介导。
[0018](项目9)根据(项目1)～(项目8)中任一项所述的方法，其中，所述方法包括确认如下内容的工序：(b)中所得的细胞为在线粒体中表达选自柠檬酸合酶(CS)、乌头酸酶2(ACO2)(aconitase 2)、异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、苹果酸脱氢酶2(MDH2)、苹果酸酶3(ME3)、ACSS1、乙酰CoA乙酰转移酶1(ACAT1)、丙酮酸脱氢酶(PDH)、BCAT2及支链酮酸脱氢酶2(BCKDH2)中的1种或多种代谢相关酶的细胞。
[0019](项目10)根据(项目1)～(项目9)中任一项所述的方法，其中，所述方法包括确认如下内容的工序：(b)中所得的细胞不表达或几乎不表达ATP柠檬酸裂解酶(ACLY)、乌头酸酶1(ACO1)、异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)、苹果酸脱氢酶1(MDH1)、苹果酸酶1(ME1)、ACSS2、乙酰CoA乙酰转移酶2(ACAT2)和/或乳酸脱氢酶(LDH)。
[0020](项目10A)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，(b)中所得的细胞中的IDH1
和/或ACSS2的表达与非人功能性角膜内皮细胞相比减弱。
[0021](项目10B)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，(b)中所得的细胞中，不表达ATP柠檬酸裂解酶(ACLY)。
[0022](项目10C)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，(b)中所得的细胞中的IDH2的表达与非人功能性角膜内皮细胞相比增强。
[0023](项目11)根据(项目1)～(项目10)中任一项所述的方法，其中，所述方法包括确认如下内容的工序：(b)中所得的细胞被确认到表达与角膜内皮(细胞)功能特性相关联的离子通道和/或单羧酸转运体，所述角膜内皮(细胞)功能特性为角膜混浊、水肿的改善，其结果能持续地长期保持角膜内皮组织细胞密度，实现视力改善。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种方法，其是制造在向人的眼前房内注入时能引发人角膜功能的人功能性角膜内皮细胞的方法，所述方法包括：(b)使角膜内皮前体细胞在能将增殖应激等培养应激极小化的培养条件下增殖和/或分化
·
成熟的工序。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述人角膜功能包括角膜内皮细胞功能特性。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述方法还包括：(a)使来自人角膜内皮组织的细胞脱分化而得到所述角膜内皮前体细胞的工序。4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其是制造在向人的眼前房内注入时能引发人角膜功能、特别是角膜内皮细胞功能特性的功能性人角膜内皮细胞的方法，所述方法使人角膜内皮前体细胞在细胞生长因子的存在下增殖和/或分化
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成熟，所述细胞生长因子的量低于发生转化的量。5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述细胞生长因子包括上皮生长因子(EGF)。6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，所述转化包括内皮
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间充质转化。7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述增殖和/或分化
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成熟的工序在ROCK抑制剂的存在下进行。8.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述方法包括确认如下内容的工序：(b)中所得的细胞为在线粒体中线粒体依赖性氧化的磷酸化增加、在细胞质
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核内的乙酰CoA的表达不增加、并且不引发表观遗传性多基因表达的细胞，所述表观遗传性多基因表达由通过乙酰CoA进行的组蛋白乙酰化介导。9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，所述方法包括确认如下内容的工序：(b)中所得的细胞为在线粒体中表达选自柠檬酸合酶(CS)、乌头酸酶2(ACO2)、异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、苹果酸脱氢酶2(MDH2)、苹果酸酶3(ME3)、ACSS1、乙酰CoA乙酰转移酶1(ACAT1)、丙酮酸脱氢酶(PDH)、BCAT2及支链酮酸脱氢酶2(BCKDH2)中的1种或多种代谢相关酶的细胞。10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，所述方法包括确认如下内容的工序：(b)中所得的细胞不表达或几乎不表达ATP柠檬酸裂解酶(ACLY)、乌头酸酶1(ACO1)、异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)、苹果酸脱氢酶1(MDH1)、苹果酸酶1(ME1)、ACSS2、乙酰CoA乙酰转移酶2(ACAT2)和/或乳酸脱氢酶(LDH)。11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，所述方法包括确认如下内容的工序：(b)中所得的细胞被确认到表达与角膜内皮(细胞)功能特性相关联的离子通道和/或单羧酸转运体，所述角膜内皮(细胞)功能特性为角膜混浊、水肿的改善，其结果能持续地长期保持角膜内皮组织细胞密度，实现视力改善。12.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，所述方法包括确认如下内容的工序：(b)中所得的细胞使钠/氢交换体1(NHE1)和/或水通道蛋白1(AQP
‑
1)的表达亢进。13.根据权利要求9～10中任一项所述的方法，其中，所述方法包括确认如下内容的工序：(b)中所得的细胞使重碳酸脱水酶5B(CA5B)的表达亢进。14.根据权利要求1～12中任一项所述的方法，其中，所述方法包括确认如下内容的工序：(b)中所得的细胞具有不存在于细胞质、核中而细胞器选择性地定位于线粒体中的特
性，以使与TCA循环等有关的代谢酶、乙酰辅酶A等代谢产物不会导致夹杂相转移细胞的生成。15.根据权利要求1～14中任一项所述的方法，其中，所述人功能性角膜内皮细胞以如下细胞作为起源来制作，所述细胞选自来自角膜内皮组织的细胞、多能性干细胞、间质干细胞、从角膜内皮采集的角膜内皮前体细胞、从角膜内皮采集的细胞、以及利用直接编程法制作的角膜内皮前体细胞及角膜内皮样细胞。16.一种细胞，其是人功能性角膜内皮细胞，其被确认到表达与角膜内皮(细胞)功能特性相关联的功能性蛋白、或者其不引发或降低阻碍该角膜内皮(细胞)功能特性的蛋白，所述角膜内皮(细胞)功能特性为角膜混浊、水肿的改善，其结果能持续地长期保持角膜内皮组织细胞密度，实现视力改善。17.根据权利要求16所述的细胞，其中，所述细胞为在向人眼前房内注入时能引发人角膜内皮功能特性的人功能性角膜内皮细胞，其在线粒体中表达选自柠檬酸合酶(CS)、乌头酸酶2(ACO2)、异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、苹果酸脱氢酶2(MDH2)、苹果酸酶3(ME3)、ACSS1、乙酰CoA乙酰转移酶1(ACAT1)、丙酮酸脱氢酶(PDH)、BCAT2及支链酮酸脱氢酶2(BCKDH2)中的1种或多种代谢相关酶。18.根据权利要求16或17所述的细胞，其中，所述细胞为在向人眼前房内注入时能引发人角膜内皮功能特性的人功能性角膜内皮细胞，其包括选自如下特性中的至少一者：在线粒体中线粒体依赖性氧化的磷酸化增加或者在细胞质
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核内的乙酰CoA的表达不增加、以及不引发由通过乙酰CoA进行的组蛋白乙酰化介导的表观遗传性的多基因表达。19.根据权利要求16～18中任一项所述的细胞，其中，所述细胞为人角膜内皮细胞，其不表达或实质上不表达ATP柠檬酸裂解酶(ACLY)、乌头酸酶1(ACO1)、异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)、苹果酸脱氢酶1(MDH1)、苹果酸酶1(ME1)、ACSS2、乙酰CoA乙酰转移酶2(ACAT2)和/或乳酸脱氢酶(LDH)。20.根据权利要求16～19中任一项所述的细胞，其中，在所述人功能性角膜内皮细胞中，钠/氢交换体1(NHE1)和/或水通道蛋白1(AQP
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1)的表达亢进。21.根据权利要求16～20中任一项所述的细胞，其中，在所述人功能性角膜内皮细胞中，重碳酸脱水酶5B(CA5B)的表达亢进。22.根据权利要求16～21中任一项所述的细胞，其中，所述人功能性角膜内皮细胞包括选自如下...

【专利技术属性】
技术研发人员：木下茂，羽室淳尔，外园千惠，上野盛夫，户田宗豊，
申请(专利权)人：京都府公立大学法人，
类型：发明
国别省市：