由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性β细胞制造技术

本发明专利技术涉及由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性β细胞。本发明专利技术还涉及通过所述方法产生的功能性β细胞和所述β细胞的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性β细胞
本专利技术涉及由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法。
技术介绍
胰岛细胞移植已被用于治疗1型糖尿病患者，显示出优于胰岛素疗法的葡萄糖稳态，但是该疗法受到器官捐献的限制。诸如人胚胎干细胞(hESC)的人多能干细胞(hPSC)可以无限增殖并分化成包括β细胞(BC)在内的许多细胞类型，因此可以解决供体胰岛的短缺。在WO2012/175633、WO2014/033322和WO2015/028614中已分别提供了在体外将hPSC分化成定形内胚层(DE)、胰腺内胚层(PE)细胞和内分泌祖细胞(EP)的方案。由hPSC体外制备葡萄糖响应性胰岛素分泌BC是具有挑战性的。大多数方案导致产生胰岛素的细胞不能重现BC的表型，因为这些细胞也共表达其他激素，如胰高血糖素，并且对葡萄糖刺激无响应。Rezania，A.等人“Reversalofdiabeteswithinsulin-producingcellsderiVedinVitrofromhumanpluripotentstemcells”NatureBiotechnology32，1121-1133(2014)和Pagliuca，F.W.等人“GenerationofFunctionalHumanPancreaticbCellsInVitro”Cell159(2)，428-439，2014年10月9日，报道了hESC在体外分化成胰岛素分泌细胞。使用静态温育研究，来自两组的细胞都对葡萄糖刺激敏感，显示葡萄糖刺激后胰岛素产量增加大约2倍。然而，这种响应无论是在质量上还是在数量上均与原代成体β细胞的响应不同。作为比较，据报道，人胰岛刺激指数为2至10或更高(Shapiro，J.A.M.等人，“IsletTransplantationinsevenpatientswithtype1diabetesmellitususingaglucocorticoid-freeimmunosuppressiveregimen”NewEnglandJournalofMedicine343，230-238，7月27日(2000年))。所报道的干细胞衍生的BC在动态细胞灌注试验中也未能显示出对葡萄糖的胰岛素响应，因此相对于原代人BC其在功能上不成熟。用于由hPSC衍生的内分泌祖细胞形成能够在动态细胞灌注试验中响应于葡萄糖的功能性成熟BC的有效方案是未知的。改进现有方案以生成全功能性成熟BC用于与人胰岛相似的更一致的细胞产物，以获得移植后的可预测结果以及对于体外筛选目的都是至关重要的。
技术实现思路
本专利技术涉及由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的改进的方法。本专利技术还涉及完全分化的葡萄糖响应性β细胞。本专利技术还涉及可通过本专利技术的方法获得的功能性成熟β细胞。本专利技术还涉及所述细胞的医学应用，尤其是在1型糖尿病的治疗上。本专利技术也可以解决从示例性实施方案的公开内容中将会明显看出的其他问题。附图说明图1示出了筛选途径，其中未分化的人胚胎干细胞(hESC)分化成定形内胚层(DE)并重新接种在T75烧瓶中，在其中细胞进一步分化为胰腺内胚层(PE)和内分泌祖细胞(EP)。在EP阶段开始β细胞(BC)步骤1筛选，并持续4-7天，并通过对NKX6.1+/INS+/GCG-细胞数目的qICC监测和/或流式细胞术进行分析。在BC步骤1筛选结束时开始BC步骤2筛选，并在3D悬浮培养物中持续3-7天的时间，这是通过在BC步骤1结束时解离成单细胞并在定轨摇床上以50rpm重新聚集成簇而实现的。通过静态和/或动态GSIS、INS蛋白质含量、ICC和qPCR对细胞进行分析。图2示出了化合物对通过流式细胞术(FC)测量的在BC步骤1第4天的INS+/NKX6.1+/GCG-表达的影响。图3示出了在BC步骤1期间组合选中物(hit)时对INS+/NKX6.1+细胞数目的累加影响。图4示出了BC步骤1方法的时间研究。图5示出了在BC步骤2方法期间添加7天的化合物对静态GSIS的影响。图6A示出了在BC步骤2的第3天存在葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞。图6B示出了在BC步骤2的第7天存在葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞。图7示出了通过剂量依赖性葡萄糖和磺酰脲介导的胰岛素的动态方式释放所证明的，hESC衍生的β细胞的功能性。图8示出了从独立的多能细胞系诱导功能性β细胞的稳健方案。图9示出了在BC步骤2的第9天在干细胞衍生的β细胞中表达的β细胞特异性基因。图10示出了通过针对INS+/NKX6.+细胞进行分选对β细胞标志物的富集。图11示出了移植了干细胞衍生的β细胞的糖尿病小鼠显示出血糖的快速降低和糖尿病逆转。图12示出了移植细胞的腹膜内葡萄糖耐量试验(IPGTT)。图13示出了干细胞衍生的β细胞防止在链脲佐菌素治疗后的高血糖症。图14示出了在移植的小鼠中的高水平循环人C-肽。专利技术描述本专利技术的专利技术人已经进行了大量的小分子筛选，并确定了一种由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞阶段生成功能性成熟β细胞(BC)的新颖且简单的两步方法。所述方案的第一步(BC步骤1)诱导高比例的INS+和NKX6.1+双阳性细胞以及仅少量GCG阳性细胞。该方案的第二步(BC步骤2)生成在体外对反复的葡萄糖攻击有强烈响应的功能性成熟BC。重要的是，所述hPSC衍生的BC细胞在动态灌注试验中响应于反复的葡萄糖+/-毒蜥外泌肽4攻击。得到的功能性成熟BC也在移植到非糖尿病小鼠的肾囊3周后对体内升高的葡萄糖水平有响应。本专利技术的专利技术人已经发现，在细胞移植后体内施用γ-氨基丁酸(GABA)可以潜在地增强移植的BC的功能效应。所得的全功能性BC群体可用作基于体外的BC产物来研究人BC功能，筛选化合物以用于调节胰岛素分泌、胰岛素蛋白质加工、胰岛素分泌和机制、GSIS研究、钙流入信号传导、自身免疫BC破坏以及BC转分化。贯穿本申请的术语方法或方案或过程可以互换使用。具体实施方式1.由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其包括以下步骤：(1)在基础培养基中包含组蛋白甲基转移酶EZH2抑制剂、转化生长因子β(TGF-β)信号通路抑制剂、肝素和烟酰胺的培养基中培养干细胞衍生的内分泌祖细胞，以获得INS+和NKX6.1+双阳性未成熟β细胞，以及(2)用12％KOSR和GABA培养步骤(1)中获得的β细胞，以获得功能性成熟β细胞。2.根据实施方案1的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中组蛋白甲基转移酶EZH2抑制剂为3-去氮腺嘌呤A(DZNep)。3.根据实施方案2的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中DZNep的浓度低于1μM。4.根据实施方案2的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中DZNep的浓度为1μM。5.根据实施方案2的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中DZNep的浓度在1μM至10μM的范围内。6.根据实施方案2的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中DZNep的浓度为10μM。7.根据实施方案1的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其包括以下步骤：(1)在基础培养基中包含组蛋白甲基转移酶EZH2抑制剂、TGF‑β信号通路抑制剂、肝素和烟酰胺的培养基中培养干细胞衍生的内分泌祖细胞，以获得INS+和NKX6.1+双阳性未成熟β细胞，以及(2)用12％KOSR和GABA培养在步骤(1)中获得的β细胞以获得功能性成熟β细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.02.24 EP 16157181.51.由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其包括以下步骤：(1)在基础培养基中包含组蛋白甲基转移酶EZH2抑制剂、TGF-β信号通路抑制剂、肝素和烟酰胺的培养基中培养干细胞衍生的内分泌祖细胞，以获得INS+和NKX6.1+双阳性未成熟β细胞，以及(2)用12％KOSR和GABA培养在步骤(1)中获得的β细胞以获得功能性成熟β细胞。2.根据权利要求1所述的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中组蛋白甲基转移酶EZH2抑制剂为3-去氮腺嘌呤A(DZNep)。3.根据权利要求1所述的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中TGF-β信号通路抑制剂为Alk5iII。4.根据权利要求1所述的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其包括与选自γ-分泌酶抑制剂、cAMP升高剂、甲状腺激素信号通路激活剂及其组合的一种或多种附加剂组合的步骤(1)。5.根据权利要求4所述的由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性成熟β细胞的方法，其中γ-分泌酶抑制剂为DAPT。6.根据权利要求4所述的由...

【专利技术属性】
技术研发人员：NS克里斯特弗森，U多恩，M汉森，
申请(专利权)人：诺和诺德股份有限公司，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK