由人多能干细胞向下丘脑神经元的分化诱导制造技术

本发明专利技术提供由人多能干细胞高效地分化诱导为下丘脑神经元的方法。另外，本发明专利技术提供由人多能干细胞构建下丘脑组织和垂体组织一体化的细胞结构体的方法。本发明专利技术通过包括如下步骤的方法得到含有下丘脑组织的细胞结构体，所述步骤为：将人多能干细胞的凝集块在含有低浓度的骨形态发生因子信号转导通路激活物质和低浓度的作用于Shh信号通路的物质的培养基中进行悬浮培养的步骤，以及将在该步骤中得到的细胞凝集块在含有低浓度的作用于Shh信号通路的物质的培养基中进一步进行悬浮培养的步骤。另外，通过包括如下步骤的方法得到含有下丘脑组织和垂体组织的细胞结构体，所述步骤为：将人多能干细胞的凝集块在含有骨形态发生因子信号转导通路激活物质和作用于Shh信号通路的物质的培养基中进行悬浮培养的步骤，将该步骤中形成的细胞凝集块在含有骨形态发生因子信号转导通路激活物质和作用于Shh信号通路的物质的培养基中进一步进行悬浮培养的步骤，以及将该步骤中得到的细胞凝集块在适于垂体和下丘脑的同时诱导的培养基中进行悬浮培养的步骤。

Differentiation of human thalamic neurons induced by human pluripotent stem cells

The invention provides a method for inducing human pluripotent stem cells to differentiate into hypothalamic neurons efficiently. In addition, the invention provides a method for constructing a cell structure integrating hypothalamic tissue with pituitary tissue from human pluripotent stem cells. A cell structure containing hypothalamic tissue is obtained by suspension culture of a human pluripotent stem cell agglutinate in a medium containing a low concentration of bone morphogenetic factor signal transduction pathway activator and a low concentration of a substance acting on the Shh signaling pathway. Steps and steps for further suspension culture of the cell agglutinate obtained in this step in a medium containing a low concentration of substances acting on the Shh signaling pathway. In addition, a cell structure containing hypothalamic and pituitary tissues is obtained by suspension culture of a human pluripotent stem cell agglutinate in a medium containing an activator of the bone morphogenetic factor signal transduction pathway and a substance acting on the Shh signaling pathway. The step of further suspension culture of the cell agglutinate formed in this step in a medium containing an activator of bone morphogenetic factor signaling pathway and a substance acting on the Shh signaling pathway, and the cell agglutinate obtained in this step in a medium suitable for simultaneous induction of pituitary and hypothalamus Steps of suspension culture.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】由人多能干细胞向下丘脑神经元的分化诱导
本专利技术涉及将人多能干细胞分化为下丘脑神经元的技术及其应用。本申请主张基于2016年1月22日提出申请的日本专利申请第2016－10940号的优先权，该专利申请的全部内容通过参照援引入本说明书中。
技术介绍
下丘脑是用于维持成长·青春期·代谢·应激反应·生殖·哺乳保育·免疫等人体内稳态的中枢。特别是最近，对伴随糖尿病等生活习惯病的增加的食欲控制的关注提高，而食欲中枢也存在于下丘脑。此外，作为下丘脑激素之一的催产素除了一直以来所说到的排乳·子宫收缩效果以外，还与信任关系、爱情有关的报告增加，表明其是与人的生活密切相关的激素。如果下丘脑产生异常，则不进行正常的激素分泌，引起中枢性尿崩症等疾病、摄食障碍、睡眠障碍等。对因下丘脑的异常所致的激素分泌不足进行激素补充疗法。但是，激素补充疗法存在限制，大多得不到充分的效果。本来，激素的分泌量对应于环境的变化而进行调节。通过来自外部的补充再现这样的生物体所具备的调节机构事实上可以说是不可能的。由于下丘脑位于大脑的深部，并且是较小的区域，因此，难以将实际的组织取出而用于研究。另一方面，尝试由ES细胞等多能干细胞制作下丘脑神经元。例如，2008年Wataya等开发了SFEBq法，确立了由小鼠ES细胞分化诱导下丘脑AVP产生细胞的方法(非专利文献1)。在SFEBq法中使用不含血清、生长因子的gfCDM培养基，在非粘附的板内使细胞凝集而进行三维悬浮培养，分化为神经组织。2015年，Merkle等使用三维悬浮培养和二维平面培养这2种方法，成功由人ES细胞和iPS细胞分化诱导为下丘脑神经元(非专利文献2)。现有技术文献非专利文献非专利文献1：WatayaT.etal.,MinimizationofexogenoussignalsinEScellcultureinducesrostralhypothalamicdifferentiation.ProcnatlAcadSciUSA105(33):11796-11801(2008).非专利文献2：MerkleFTetal.,Generationofneuropeptidergichypothalamicneuronsfromhumanpluripotentstemcells.Development.2015Feb15；142(4):633-43.非专利文献3：OzoneCetal.,Functionalanteriorpituitarygeneratedinself-organizingcultureofhumanembryonicstemcells.natCommun.2016Jan14；7:10351.。
技术实现思路
如上所述，尝试了将多能干细胞分化诱导为下丘脑神经元。但是，在Wataya等的方法中，人ES细胞时未顺利地分化。另外，在Merkle等的方法中，三维培养时AVP分化效率非常差(分化效率为0.2％左右)，二维培养中未成功地进行AVP神经元的分化。如果能够确立将人多能干细胞(ES细胞、iPS细胞)分化诱导为下丘脑神经元的方法，换言之构建下丘脑组织的方法，则针对下丘脑障碍的治疗法的开发大幅前进。例如，能够开发使用由中枢性尿崩症患者建立的疾病特异性iPS细胞的病理解析、治疗法。另外，也可期待应用于移植医疗。另一方面，由于下丘脑和垂体原本功能上是不可分开的，因此，下丘脑和垂体功能上一体化的结构体是对将下丘脑和/或垂体作为靶的新药筛选等极其有效的工具。另外，该结构体作为对下丘脑和/或垂体的功能障碍的移植材料，有用性也高。在以上的背景下，本专利技术的第1课题在于提供将人多能干细胞高效地分化诱导为下丘脑神经元的方法。另外，第2课题在于提供由人多能干细胞构建下丘脑组织和垂体组织一体化的细胞结构体的方法。本专利技术人等为了解决上述课题反复进行了研究。首先，Merkle等的方法未必是按照发生的顺序的分化法，由它们的结果进行推测，认为分化为下丘脑中的腹侧。通常在下丘脑内背侧确认到AVP神经元。因此，本专利技术人等对依次再现发生的各阶段的分化条件进行检索并优化，由此进一步精密地控制下丘脑内的诱导位置，作为结果认为可得到背侧下丘脑的AVP神经元。作为各分化步骤的标记物，设定作为下丘脑初始标记物的Rx(retinaandanteriorneuralfoldhomeobox)，接着设定作为背侧标记物的Pax6(pairedbox6)，然后设定作为AVP的真正的(Bonafide)标记物的Otp(orthopediahomeobox)和Brn2(也作为POU3F2、POUclass3homeobox2等已知)，最后设定AVP。首先，遵循Wataya等的方法(非专利文献1)，仅使用不含生长因子的化学合成培养基(growth-factor-freeChemica11yDefinedMedium；gfCDM)尝试分化，结果细胞未顺利地形成凝集块。认为营养不足是原因，将血清代替物KSR少量添加到培养基中，结果虽然形成了凝集块，但位置信息向端脑偏离。因此，加入BMP4信号，结果虽然作为下丘脑标记物的Rx和作为背侧标记物的Pax6均成为阳性，但视网膜标记物Chx10也成为阳性，判明成为神经视网膜。因此，加入腹侧化因子的Shh(Sonichedgehog)信号(作为Shh激动剂的SAG)，结果能够分化为下丘脑祖细胞。进一步进行研究，结果调整KSR浓度、BMP4信号和Shh信号(SAG)的浓度，并且通过有无添加少量的其它作为腹侧化信号的Akt抑制剂，成功地分别制作背侧下丘脑和腹侧下丘脑。即，发现背侧下丘脑诱导条件和腹侧下丘脑诱导条件。在背侧下丘脑诱导条件下继续悬浮培养，结果确认到Otp和Brn2的表达，在培养第100天确认到AVP的表达，但其数量微少。因此，并入对神经产生有利的分散培养，结果在培养第150天确认到AVP神经元的出现。另外，确认到该AVP神经元实际上分泌AVP激素。进而，AVP神经元在刺激试验中显示良好的反应性。确认到如果在背侧下丘脑诱导条件或腹侧下丘脑诱导条件下进行培养，则也能够分化诱导AVP神经元以外的下丘脑神经元。在腹侧下丘脑条件下继续培养时，比背侧下丘脑诱导条件高效地确认到MCH神经元等腹侧下丘脑神经元。另一方面，通过组合下丘脑神经元成熟条件(分散培养用培养基的使用)，并调整各阶段的条件，成功地由一个细胞块分化·成熟下丘脑和垂体这两者。如上所述，本次研究的结果，与Merkle等的方法相比，能够更高效地分化诱导为下丘脑神经元(例如AVP神经元)。另外，能够准确地分别制作下丘脑的背侧和腹侧，结果能够更精密地控制分化诱导本身。不仅能够分化诱导AVP神经元，而且也能够分化诱导产生也被称为爱情激素的催产素的神经元、与食欲相关的多个下丘脑激素产生神经元。进而，也成功地构建了下丘脑和垂体功能上一体化的结构体。以下的专利技术主要基于上述成果。[1]一种含有下丘脑组织的细胞结构体的制造方法，包括以下的步骤(1)和(2)：(1)将人多能干细胞的凝集块在含有低浓度的骨形态发生因子信号转导通路激活物质和低浓度的作用于Shh信号通路的物质的培养基中进行悬浮培养的步骤，(2)将步骤(1)中得到的细胞凝集块在含有低浓度的作用于Shh信号通路的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含有下丘脑组织的细胞结构体的制造方法，包括以下的步骤(1)和(2)：(1)将人多能干细胞的凝集块在含有低浓度的骨形态发生因子信号转导通路激活物质和低浓度的作用于Shh信号通路的物质的培养基中进行悬浮培养的步骤，(2)将步骤(1)中得到的细胞凝集块在含有低浓度的作用于Shh信号通路的物质的培养基中进一步进行悬浮培养的步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.01.22 JP 2016-0109401.一种含有下丘脑组织的细胞结构体的制造方法，包括以下的步骤(1)和(2)：(1)将人多能干细胞的凝集块在含有低浓度的骨形态发生因子信号转导通路激活物质和低浓度的作用于Shh信号通路的物质的培养基中进行悬浮培养的步骤，(2)将步骤(1)中得到的细胞凝集块在含有低浓度的作用于Shh信号通路的物质的培养基中进一步进行悬浮培养的步骤。2.根据权利要求1所述的制造方法，其中，在高氧分压条件下进行步骤(2)。3.根据权利要求1或2所述的制造方法，其中，进一步包括以下的步骤(3)：(3)回收步骤(2)中得到的细胞凝集块，将构成细胞凝集块的细胞进行分散培养的步骤。4.根据权利要求3所述的制造方法，其中，在高氧分压条件下进行步骤(3)。5.根据权利要求1～4中任一项所述的制造方法，其中，步骤(1)中的所述骨形态发生因子信号转导通路激活物质为BMP4，培养基中的其浓度为0.1nM～5.0nM，步骤(1)和(2)中的所述作用于Shh信号通路的物质为SAG，培养基中的其浓度为0.1μM～2.0μM，通过所述步骤(1)和(2)来诱导向背侧下丘脑组织的分化。6.根据权利要求5所述的制造方法，其中，所述背侧下丘脑组织包含选自血管加压素神经元、催产素神经元、促甲状腺激素释放激素神经元、促肾上腺皮质激素释放激素神经元和神经肽Y神经元中的一种以上的神经元。7.根据权利要求1～4中任一项所述的制造方法，其中，步骤(1)中的所述骨形态发生因子信号转导通路激活物质为BMP4，培养基中的其浓度为0.1nM～3.0nM，步骤(1)和(2)中的所述作用于Shh信号通路的物质为SAG，培养基中的其浓度为0.1μM～2.0μM，所述培养基进一步含有Akt抑制剂，通过所述步骤(1)和(2)来诱导向腹侧下丘脑组织的分化。8.根据权利要求7所述的制造方法，其中，所述腹侧下丘脑组织包含选自刺鼠相关蛋白神经元、前阿黑皮素原神经元、黑色素凝集激素神经元和食欲素神...

【专利技术属性】
技术研发人员：须贺英隆，小川晃一郎，笠井贵敏，有马宽，
申请(专利权)人：国立大学法人名古屋大学，
类型：发明
国别省市：日本,JP