汇集肝细胞的方法技术

本发明专利技术涉及制备冷冻保存的细胞(例如，肝细胞)的汇集或混合群体的新颖方法。具体地，本发明专利技术需要对由单个个体供给的细胞(例如肝细胞)进行快速解冻，混合所述细胞以产生异质群体然后冷冻保存。本发明专利技术还涉及多冷冻保存细胞的制备以在临近使用前增加活力。该过程需要减少暴露于化学和物理应力，以增加最终的活细胞数量。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】汇集肝细胞的方法著作权声明本专利申请文件的一部分公开内容包含受版权保护的材料(包括附图)。著作权所有人不反对任何人对美国专利商标局存档或记录中出现的专利文件或专利公开内容进行复制，但在其他任何方面保留所有著作权。交叉引用和相关申请本申请要求以下共同待审申请中的每一项的权益：2015年2月27日提交的美国专利申请号62/121,619，其全部内容通过引用纳入本文。专利
本专利技术大致涉及汇集和冷冻保存来自多个供体的肝细胞。
技术介绍
肝细胞构成肝脏中大约80％的细胞，并且对于许多药物化合物、毒素或外源性物质的活化和最终解毒都是关键的。在批准上市之前，对新药的需求和可及性的增加以及更严格的监管和安全性测试使得分离的原代肝细胞成为在实验室环境中研究药物代谢、功效和毒性的宝贵资源。近年来，在原代供体肝细胞的分离和冷冻保存方面取得了显著进步，可以将原代供体肝细胞快速解冻并立即用于实验。然而，因为性别、年龄、种族、健康状况、遗传背景和其他因素的差异性使测试结果存在偏差，因此，研究从一个人类肝脏(个体供体)中分离出来的肝细胞中的肝脏代谢不能准确地反映总群体的肝功能。更准确地测定肝脏代谢使用的是各单个供体细胞的混合物或“汇集物”，以产生异质的肝细胞群。现已提出了用于汇集肝细胞的许多方法。这些方案通常采用冗长的程序，其中细胞暴露于会减少活细胞总数的物理和化学应力。例如，美国专利7,604,929中的方法在第二和最终冷冻保存步骤前采用密度梯度离心步骤。这使细胞受到化学和机械应力，导致细胞减损(图1A-B)或使细胞变弱，使得它们在冷冻保存期间死亡。在WO2014/045202A2中公开的另一方法在整个汇集过程中将肝细胞维持在冷冻保护剂溶液中。冷冻保护剂溶液包含有毒试剂，例如已知会导致细胞死亡的二甲基亚砜(DMSO)。所提出的系统和方法寻求采用降低细胞减损的技术，从而增加整个过程中活细胞的总数。
技术实现思路
本申请力图增加肝细胞汇集过程中获得的活细胞的数量。一种用于冷冻保存来自多个来源的肝细胞的方法，所述方法包括如下步骤：A)解冻来自多个来源的肝细胞；B)将来自多个来源的肝细胞汇集到保存溶液中；C)将汇集的肝细胞进行离心以引起活肝细胞和无活力肝细胞成团；D)去除保存溶液；E)将成团的活肝细胞和成团的无活力肝细胞与冷冻保存剂合并；F)将汇集的肝细胞分配到小瓶中；以及G)将在小瓶中的肝细胞进行冷冻保存。上述方法可以使用不同类型的肝细胞，所述肝细胞包括选自下组的那些：人肝细胞、猪肝细胞、猿肝细胞、犬肝细胞、猫肝细胞、牛肝细胞、马肝细胞、绵羊肝细胞和啮齿动物肝细胞。各个体来源可以基于性别、种族、年龄，代谢状态或健康状况进行汇集。在某些情况下，基于当时存在的样本集，汇集物可以是随机的。可以使用的保存溶液类型包括：威斯康星大学溶液(UniversityofWisconsinsolution)、HypoThermosol(低热熔胶)培养基、或HypoThermosol-FRS、以及降低冷冻保存剂的毒性和/或为肝细胞提供必需营养物质的其它类似保存溶液。例如，保存溶液可包括胎牛血清。离心步骤没有密度梯度，以减少细胞上的物理和化学应力。该离心步骤使得活肝细胞和无活力肝细胞成团。可以先将团块与与冷冻保护剂合并，再进行冷冻。当冷冻保存剂与成团细胞合并时，上下抽吸、涡旋、来回摇动小瓶、轻拍小瓶、或类似过程可用于使得细胞重悬于冷冻保存剂溶液中。当通过等分试样或其它方法将成团的肝细胞分配到小瓶中时，汇集的细胞可以800-1500万个细胞/毫升的密度进行分配。在一实施方式中，使用1333万个细胞/毫升。在汇集的肝细胞最终解冻后，使用者可以在进行实验之前立即进行密度梯度分离以分离开活细胞和无活力细胞。在一些情况下，密度梯度离心步骤在50RCF至200RCF之间进行。密度梯度分离可以包括通过涂覆有聚乙烯基吡咯烷酮的胶体二氧化硅颗粒(Percoll)进行密度离心。可以对这些过程中使用的肝细胞进行铺板或在悬浮液中使用。附图说明图1A-B显示了在具有或有具有Percoll梯度的连续离心后活大鼠肝细胞的产率。图2是用于汇集和冷冻保存来自个体供体的预先冷冻保存的肝细胞的方法示意图。图3是从图2的最后一个冷冻保存步骤中分离出活细胞和无活力细胞的方法示意图。具体实施方式本文描述了用于从来自个体供体的预先冷冻保存的肝细胞制备冷冻保存的细胞(例如肝细胞)汇集物的得以改进的系统和方法的说明。该系统和方法减少了在汇集过程中对肝细胞的物理和化学应力，同时在最终使用者进行解冻后离心步骤期间，提高了汇集的活细胞的回收率。通常，该系统和方法包括解冻个体供体肝细胞的小瓶并将它们汇集到保存溶液中。然后，将汇集的细胞短暂离心，使得活细胞和无活力细胞成团，随后以高密度冷冻保存在多个小瓶中。然后，最终使用者可以在实验使用之前即刻进行密度梯度离心以使活细胞与无活力细胞分离。所提出方法的一些优点在于，在对汇集的肝细胞进行实验之前，减少了曝露于使活细胞数量减少的机械、化学和其它环境因素。在一实施方式中，将来自个体供体的之前分离且冷冻保存的肝细胞储存在至少-150℃下的液氮气相中。可以随机或基于特定的代谢活性(例如ECOD、细胞色素P450、一般I期或II期)、年龄、种族，性别、族群或其它表型决定因素来选择待汇集的个体供体小瓶。解冻的小瓶数量取决于混合群中包含的个体数量和待生成的汇集物大小。例如，用于每个肝细胞集合物的个体小瓶数量可以是2至50个个体。每个汇集物的范围可以是300至1000个小瓶。例如，具有300个小瓶的10个供体的汇集物将会需要来自每个供体的约30个小瓶。通过将小瓶浸没在保持在37℃的水浴中约2分钟或直到几乎看不到冰轴，然后将内容物迅速倒入包含4℃保存溶液的容器中来解冻各个供体肝细胞。保存溶液用于稀释冷冻保存剂中发现的DMSO(和/或对肝细胞有毒的任何其它试剂)。在一些情况下，保存溶液还为肝细胞提供必需营养物质，以促进汇集过程中的活力。保存溶液的体积取决于待产生的汇集物的大小，但可以包含，例如保存溶液与1mL冷冻保存细胞为1:1的比例。保存溶液可包括威斯康星大学溶液(10mM乳糖酸钾、25mMKH2P04、5mMMgSO4、30mM棉子糖、5mM腺苷、3mM谷胱甘肽、1mM别嘌呤醇和50g/L羟乙基淀粉)；HypoThermosol培养基(HTS培养基)，HypoThermosol-FRS(HTS-FRS)，或添加或不添加胎牛血清(FBS)的其它此类培养基。将肝细胞保持在4℃的保存溶液中，同时将多个小瓶的肝细胞解冻并在同一容器中进行混合以产生多个供体细胞的“汇集”群体。取决于要解冻的小瓶数量，解冻的肝细胞可以在保存溶液中保留2-10小时。在解冻并汇集了多个小瓶的肝细胞后，将细胞在50-200相对离心力(RCF)的范围内离心8-10分钟，以使得活细胞和无活力细胞成团。例如通过吸吮从成团的细胞中去除保存溶液。此时在该过程中使用没有密度梯度的离心步骤，降低了第二次冷冻保存之前肝细胞上的物理和化学应力。图1A-B显示了与没有密度梯度的离心相比，密度梯度(例如Percoll)离心对肝细胞可能具有的影响。在随后的每次旋转的情况下，相对于没有Percoll离心的肝细胞，在具有密度梯度(Percoll本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于冷冻保存来自多个来源的肝细胞的方法，所述方法包括如下步骤：A)解冻来自多个来源的肝细胞；B)将来自多个来源的肝细胞汇集到保存溶液中；C)对汇集的肝细胞进行离心以引起成团；D)去除保存溶液；E)将成团的活肝细胞和成团的无活力肝细胞与冷冻保存剂合并；F)将汇集的肝细胞分配到小瓶中；G)对在小瓶中的肝细胞进行冷冻保存。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于冷冻保存来自多个来源的肝细胞的方法，所述方法包括如下步骤：A)解冻来自多个来源的肝细胞；B)将来自多个来源的肝细胞汇集到保存溶液中；C)对汇集的肝细胞进行离心以引起成团；D)去除保存溶液；E)将成团的活肝细胞和成团的无活力肝细胞与冷冻保存剂合并；F)将汇集的肝细胞分配到小瓶中；G)对在小瓶中的肝细胞进行冷冻保存。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肝细胞选自下组：人肝细胞、猪肝细胞、猿肝细胞、犬肝细胞、猫肝细胞、牛肝细胞、马肝细胞、绵羊肝细胞和啮齿动物肝细胞。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多个来源包括基于性别、种族、年龄、代谢状态或健康状态的随机或预选组。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，保存溶液包含威斯康星大学溶液、超热熔胶培养基或超热熔胶-FRS。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述保存溶液还包含胎...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·凯撒，M·谢尔曼，
申请(专利权)人：三角研究实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US