分化的肠内分泌细胞和胰岛素产生细胞的制备制造技术

一种肠内分泌细胞(EEC)群，其通过以多种小分子处理哺乳动物的出生后细胞群，例如包含出生后干细胞的群而获自所述群，所述小分子上调ChgA并促进所述细胞分化形成所述肠内分泌细胞。ChgA的上调使得在所获得的细胞群中通过ChgA免疫染色检测测定的表达CGA的细胞分数为至少约1.5％。能够用于使所述出生后细胞分化为所述肠内分泌细胞的小分子可包括以下中的至少一种：Wnt激活剂、Notch抑制剂、Wnt抑制剂、MEK/ERK抑制剂、生长因子、HDAC抑制剂、组蛋白甲基化抑制剂、Tgf‑β抑制剂和NeuroD1激活剂。并且，通过用提高胰岛素表达的多种小分子处理哺乳动物细胞群来提高该群的胰岛素表达。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】分化的肠内分泌细胞和胰岛素产生细胞的制备相关申请本申请要求2016年1月8日提交的美国临时申请No.62/276,814的权益。上述申请的全部教导通过引用结合在本文中。政府支持本专利技术在国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的批准号R01DE013023的政府支持下完成。政府拥有本专利技术的某些权利。
技术介绍
肠内分泌系统通过使用多种激素来协调身体如何对营养物质反应，以调整体内广泛的生理反应，从而在消化道和代谢性疾病中发挥重要作用，例如胃肠道(GI)疾病、糖尿病和肥胖症。肠内分泌细胞(EEC)形成体内最大的内分泌系统(Grible和Reimann，2015)。EEC沿着隐窝-绒毛轴独立分散在整个肠上皮中，但体内仅存在一小部分(～1％)(Gunawardene等，2011)。EEC的关键功能是感觉腔内容物，特别是营养物质，并且通过分泌多种激素(例如GLP-1)而响应，所述多种激素调节食物摄入、能量稳态和葡萄糖耐受(Furness，2013)。还提出，EEC通过分泌激素(例如GLP-1、PYY和GLP-2)在胃旁路手术中发挥关键作用(Mumphrey，2013)。因此，EEC是糖尿病和肥胖症的治疗靶点。此外，确凿的证据证明了EEC在先天免疫中的免疫调节功能(Moran，2008)。EEC表达功能性Toll样受体(TLR)并直接响应于由共生细菌产生的代谢产物(Bogunovic，2007)。最近的证据也表明EEC可通过改变炎症期间的数量和激素分泌来直接协调免疫细胞功能(Worthington，2015)。EEC也被认为在代谢性疾病(例如糖尿病和肥胖症)和胃肠道病理，例如肠易激综合症、感染性肠炎和炎性肠病中起关键作用(Moran，2008，和Manocha和Kahn，2012)。因此，EEC对疾病干预的探索和发展有很大兴趣。然而，由于体外培养EEC的能力相对缺乏，以及EEC的分散分布和EEC在肠上皮中的相对稀缺性(1％)，肠内分泌细胞的研究受到阻碍。特别是，控制EEC分化和功能的信号的知识在很大程度上是未知的。此外，EEC的直接体外研究还不可能，因为它们是不分裂的末端分化的细胞。因此，由于EEC在肠道上皮中的分散分布和稀缺性(1％)，难以原位研究EEC的功能和调节(Sternini,Anselmi和Rosengut,2008，以及Gunawerdene,Corfe和Staton,2011)。因此，仍然需要体外EEC培养物，以允许研究代谢和消化疾病。还需要调节EEC的功能并获得特定的EEC亚型的能力，以例如用于疾病状态的发现和实施治疗。
技术实现思路
本公开内容的方面包括：通过用上调ChgA并促进所述细胞分化形成所述肠内分泌细胞的多种小分子处理哺乳动物的出生后细胞群(例如出生后干细胞群)，从而从哺乳动物的出生后细胞群(例如出生后干细胞群)获得肠内分泌细胞群(EEC)。ChgA的上调使得所获得的细胞群中通过ChgA免疫染色检测所测定的表达CGA的细胞分数为至少约1.5％。能够用于使出生后干细胞分化为肠内分泌细胞的小分子可包括以下中的至少一种：Wnt激活剂、Notch抑制剂、Wnt抑制剂、MEK/ERK抑制剂、生长因子、HDAC抑制剂、组蛋白甲基化抑制剂、Tgf-β抑制剂和NeuroD1激活剂。本公开内容的方面还包括：通过用诱导细胞以增加胰岛素表达的多种小分子处理哺乳动物细胞群，来增加该群的胰岛素表达的方法。可以在细胞群中增加胰岛素表达水平，从而使得在使用胰岛素-GFP报告物的胰岛素活性检测中，胰岛素GFP报告物被激活的细胞的分数为至少约1％。可以进行处理以增加胰岛素表达的哺乳动物细胞可以包括出生后细胞或肠内分泌细胞，例如出生后干细胞、出生后多能子代细胞和肠内分泌细胞。可用于处理以增加细胞中胰岛素表达的小分子可包括DNA甲基化抑制剂、Tgf-β抑制剂和NeuroD1激活剂。根据本公开内容的一个方面，还包括了以本文所述的EEC和/或胰岛素产生细胞治疗疾病状态的方法和/或组合物。此外，根据本公开内容的一个方面，还包括对应于所获得的EEC和/或胰岛素产生细胞的细胞群，以及包含用于制备EEC和/或胰岛素产生细胞的小分子的试剂盒。附图说明从以下对本专利技术的示例实施方式的更具体的描述，前述内容将变得显而易见，如附图中所示，其中相似的附图标记在不同图中指代相同的部分。附图不一定是按比例的，而是强调用于说明本专利技术的实施方式。图1显示利用Notch抑制剂增加了从ISC向肠内分泌细胞(EEC)的分化。图2显示在所培养的肠干细胞中ChgA的mRNA表达。图3显示了增加EEC分化的小分子的96孔筛选平台。图4显示了小分子筛选结果中的阳性命中。图5显示利用小分子和在END条件下分化的肠干细胞对阳性命中的验证。图6显示MAPK/ERK或EGFR抑制剂特异性增加EEC分化。图7显示小分子吉非替尼(Ge)、AS703026(As)或PD0325901(Pd)在EEC分化过程中降低Ngn3表达，并且R-Spondin1促进Ngn3表达。图8显示优化的分化方案。图9显示在EEC分化过程中第24h时的Ngn3表达。图10显示分化过程中第3天EEC的关键标志物的表达。图11显示在EEC分化过程中关键基因的时间进程研究。图12显示5天分化后EEC标志物ChgA表达增加的2步方案。图13显示通过5天分化后对EEC标志物ChgA进行染色而显示EEC分化增加的2步方案。比例尺:50μm。图14显示另外的小分子对分化方案的改善。图15显示当在分化方案的第1步中加入时杜巴他丁(Tubastatin)A(Tu)增加EEC分化。图16显示当在分化的两个步骤中加入时反苯环丙胺增加EEC分化。图17显示去除EGF进一步增加EEC的分化。图18显示改善的分化方案。图19显示从ISC向EEC的高效分化。比例尺:20μm。图20显示从ISC产生的功能性L细胞(GLP-1)。图21显示另外的因子，包括Wnt-C59和ISX-9及其组合，增加EEC分化。图22显示在多种条件下功能性EEC标志物的表达。图23显示从ISC分化为EEC的分化方案。图24显示5-Aza(5)、616452(6)和Wnt-C59(C)的组合，在第5天诱导分化的肠干细胞中胰岛素-GFP表达。图25显示在第5天5-Aza在诱导胰岛素-GFP表达中的剂量响应。图26显示在第5天616452在诱导胰岛素-GFP表达中的剂量响应。图27显示培养物中5天后ISX-9(I)进一步增加胰岛素-GFP表达。图28显示在第5天ISX-9在诱导胰岛素-GFP表达中的剂量响应。图29显示培养物中5天后在多种条件下细胞的胰岛素-GFP表达的FACS分析。图30显示在第7天不以或以药物处理的细胞的GFP和明视野。图31显示基因表达数据。图32显示用低浓度(2mM)和高浓度(20mM)葡萄糖处理细胞诱导不同水平的胰岛素释放。图33显示分化方案的流程图。图34显示通过Wnt和Notch途径控制的体内EEC分化的模型。图35显示如通过针对ChgA的免疫染色所确定的，Notch和EGFR/MEK/ERK抑制以及Wnt失活(通过R-Spondin1撤回)的组合诱导ISC向EEC方向特化。图36显示从所述组合中去除本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从哺乳动物的出生后细胞群获得肠内分泌细胞(EEC)群的方法，所述方法包括：用上调ChgA的多种小分子处理所述哺乳动物的出生后细胞群，以使所述出生后细胞群中的出生后细胞分化而获得细胞群，从而如在ChgA免疫染色检测中所测定的，在所获得的细胞群中表达ChgA的细胞分数为至少约1.5％。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.01.08 US 62/276,8141.一种从哺乳动物的出生后细胞群获得肠内分泌细胞(EEC)群的方法，所述方法包括：用上调ChgA的多种小分子处理所述哺乳动物的出生后细胞群，以使所述出生后细胞群中的出生后细胞分化而获得细胞群，从而如在ChgA免疫染色检测中所测定的，在所获得的细胞群中表达ChgA的细胞分数为至少约1.5％。2.如权利要求1所述的方法，其中，所述出生后细胞是出生后干细胞。3.如权利要求1所述的方法，其中，所述出生后细胞是多能子代细胞。4.如权利要求1所述的方法，其中，所述表达ChgA的细胞分数为至少约5％。5.如权利要求4所述的方法，其中，所述表达ChgA的细胞分数为至少约10％。6.如权利要求5所述的方法，其中，所述表达ChgA的细胞分数为至少约50％。7.如权利要求6所述的方法，其中，所述表达ChgA的细胞分数为约60％至约100％。8.如权利要求1所述的方法，其中，通过mRNAChgA表达检测测定的ChgA表达水平是所述出生后细胞群中表达ChgA的细胞数量的至少10倍。9.如权利要求8所述的方法，其中，所获得的群中表达ChgA的细胞数量是所述出生后细胞群中表达ChgA的细胞数量的至少约100倍。10.如权利要求9所述的方法，其中，所获得的群中表达ChgA的细胞数量是所述出生后细胞群中表达ChgA的细胞数量的约1000倍至100000倍。11.如权利要求1所述的方法，其中，所述肠内分泌细胞包括表达GLP-1、GIP、5HT、SST、胃泌素、CCK、SCT、NTS、PYY、胃泌素和胃饥饿素中至少一种的肠内分泌细胞类型。12.如权利要求1所述的方法，其中，所述多种小分子包括以下中的至少一种：Wnt激活剂、Notch抑制剂、Wnt抑制剂、MEK/ERK抑制剂、生长因子、HDAC抑制剂、组蛋白甲基化抑制剂、Tgf-β抑制剂和NeuroD1激活剂，或其衍生物或药学上可接受的盐，或其组合。13.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法包括：使所述哺乳动物的出生后细胞群与一种或多种第一小分子接触的第一阶段；和使所述哺乳动物的出生后细胞群与一种或多种第二小分子接触的第二阶段。14.如权利要求13所述的方法，其中，所述一种或多种第一小分子包括Notch抑制剂和Wnt激活剂，或其衍生物或药学上可接受的盐，并且所述一种或多种第二小分子包括EGFR抑制剂和MEK/ERK抑制剂中的至少一种以及Notch抑制剂，或其衍生物或药学上可接受的盐，或其组合。15.如权利要求14所述的方法，其中，所述一种或多种第一小分子包括R-Spondin1和DAPT，或其衍生物或药学上可接受的盐，并且所述一种或多种第二小分子包括DAPT和PD0325901，或其衍生物或药学上可接受的盐，或其组合。16.如权利要求14所述的方法，其中，所述一种或多种第二小分子还包括Wnt抑制剂。17.如权利要求16所述的方法，其中，所述Wnt抑制剂包括Wnt-C59。18.如权利要求14所述的方法，其中，所述一种或多种第一小分子或所述一种或多种第二小分子还包括生长因子，所述生长因子包括EGF和Noggin中的至少一种，或其衍生物或药学上可接受的盐，或其组合。19.如权利要求14所述的方法，其中，所述一种或多种第一小分子还包括HDAC抑制剂、组蛋白甲基化抑制剂和Ca2+/NeuroD1激活剂中的至少一种，或其衍生物或药学上可接受的盐，或其组合。20.如权利要求19所述的方法，其中，所述一种或多种第一小分子包括杜巴他丁A、反苯环丙胺和ISX-9的至少一种，或其衍生物或药学上可接受的盐，或其组合。21.如权利要求14所述的方法，其中，所述一种或多种第二小分子还包括Tgf-β抑制剂，或其衍生物或药学上可接受的盐，或其组合。22.如权利要求21所述的方法，其中，所述一种或多种第二小分子包括616452，或其衍生物或药学上可接受的盐，或其组合。23.如权利要求14所述的方法，其中，所述一种或多种第二小分子还包括组蛋白甲基化抑制剂，或其衍生物或药学上可接受的盐，或其组合。24.如权利要求23所述的方法，其中，所述一种或多种第二小分子包括反苯环丙胺，或其衍生物或药学上可接受的盐，或其组合。25.如权利要求13所述的方法，其中，所述第一阶段包括使所述出生后细胞群与上调Ngn3的一种或多种第一小分子接触以提高细胞中的Ngn3表达，并且所述第二阶段包括使所述出生后细胞群与下调Ngn3的一种或多种第二小分子接触以降低细胞中的Ngn3表达。26.如权利要求1所述的方法，其中，所述哺乳动物的出生后细胞群的至少约2％转化成肠内分泌细胞。27.如权利要求26所述的方法，其中，所述哺乳动物的出生后细胞群的至少约70％转化成肠内分泌细胞。28.如权利要求1所述的方法，其中，所述哺乳动物的出生后细胞群包括上皮干细胞、胃干细胞、肠干细胞、造血干细胞、乳腺干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞和神经干细胞中的至少一种。29.如权利要求28所述的方法，其中，所述哺乳动物的出生后细胞群包含Lgr5+肠干细胞。30.如权利要求1所述的方法，其中，所述哺乳动物的出生后细胞群是体外细胞群。31.如权利要求28所述的方法，其中，所述哺乳动物的出生后细胞群分散在细胞培养基中。32.如权利要求1所述的方法，其中，哺乳动物的出生后细胞群是体内细胞群。33.一种提高包含出生后细胞或肠内分泌细胞的哺乳动物细胞群的胰岛素表达的方法，所述方法包括：用提高所述细胞群中胰岛素表达的多种小分子处理所述哺乳动物细胞群，从而使在胰岛素活性检测中，具有激活的胰岛素GFP报告物的细胞的分数为至少约1％。34.如权利要求33所述的方法，其中，所述出生后细胞是出生后干细胞。35.如权利要求33所述的方法，其中，所述出生后细胞是出生后多能子代细胞。36.如权利要求33所述的方法，其中，胰岛素GFP报告物激活的细胞的分数为至少约20％。37.如权利要求36所述的方法，其中，胰岛素GFP报告物激活的细胞的分数为约20％至约100％。38.如权利要求33所述的方法，其中，如通过mRNA胰岛素检测所确定的，所获得的细胞具有的胰岛素表达与HprtmRNA水平的表达相应的基线相比为至少约1倍至2倍。39.如权利要求33所述的方法，其中，所述多种小分子包括DNA甲基化抑制剂、Tgf-β抑制剂和NeuroD1激活剂中的至少一种，或其衍生物或药学上可接受的盐。40.如权利要求39所述的方法，其中，所述多种小分子包括5-氮杂胞苷和5-氮杂-2’脱氧胞苷中的至少一种、616452和ISX-9，或其衍生物或药学上可接受的盐。41.如权利要求39所述的方法，其中，所述多种小分子包括以下中的至少一种：Wnt激活剂、Notch抑制剂、Wnt抑制剂、MEK/ERK抑制剂、生长因子、HDAC抑制剂、组蛋白甲基化抑制剂、Tgf-β抑制剂和NeuroD1激活剂，或其衍生物或药学上可接受的盐。42.如权利要求33所述的方法，其中，至少约1％的所获得的细胞是胰岛素产生细胞。43.如权利要求33所述的方法，其中，约1％至约20％的所获得的细胞是胰岛素产生细胞。44.如权利要求33所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞群包括Lgr5+干细胞、多能子代细胞和分化的肠内分泌细胞中的至少一种。45.如权利要求33所述的方法，其中，所述方法包括：使所述哺乳动物细胞群与一种或多种第一小分子接触的第一阶段；使所述哺乳动物细胞群与一种或多种第二小分子接触的第二阶段；和使所述哺乳动物细胞群与一种或多种第三小分子接触的第三阶段。46.如权利要求45所述的方法，其中，所述第一阶段包括使所述细胞与包括Notch抑制剂、Wnt激活剂和DNA甲基化抑制剂或其衍生物或药学上可接受的盐的一种或多种第一小分子接触，所述第二阶段包括使所述细胞与包括Notch抑制剂、Wnt抑制剂、Tgf-抑制剂和NeuroD1激活剂或其衍生物或药学上可接受的盐的一种或多种第二小分子接触，并且所述第三阶段包括使所述细胞与包括Notch抑制剂、Wnt抑制剂、MEK/ERK抑制剂和Tgf-β抑制剂或其衍生物或药学上可接受的盐或其组合的一种或多种第三小分子接触。47.如权利要求46所述的方法，其中，所述一种或多种第一小分子包括5-氮杂胞苷和5-氮杂-2’脱氧胞苷中的至少一种、R-Spondin1以及DAPT，或其衍生物或药学上可接受的盐，所述一种或多种第二小分子包括DAPT、Wnt-C59、616452和ISX-9，或其衍生物或药学上可接受的盐，并且所述一种或多种第三小分子包括DAPT、Wnt-C59、616452和PD0325901，或其衍生物或药学上可接受的盐，或其组合。48.如权利要求46所述的方法，其中，所述第一阶段还包括使所述细胞与生长因子接触，所述生长因子包括EGF和Noggin中的至少一种，或其衍生物或药学上可接受的盐，或其组合。49.如权利要求46所述的方法，其中，所述第一阶段还包括使所述细胞与HDAC抑制剂、组蛋白甲基化抑制剂和Ca2+influx/NeuroD1激活剂中的至少一种，或其衍生物或药学上可接受的盐，或其组合接触。50.如权利要求49所述的方法，其中，所述第一阶段包括使所述细胞与杜巴他丁、反苯环丙...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·M·卡普，R·S·兰格，尹晓磊，
申请(专利权)人：麻省理工学院，布里格海姆妇女医院公司，
类型：发明
国别省市：美国,US