肝细胞的生产方法技术

本发明专利技术公开了由人多能干细胞生产肝细胞的方法。将干细胞接种到包含两种层粘连蛋白的细胞培养基底上。然后将干细胞暴露于不同的细胞培养基以诱导分化。与在不同基底上培养的肝细胞相比，所得的肝细胞具有更高的代谢能力。

Production of hepatocytes

The invention discloses a method for producing hepatocytes from human pluripotent stem cells. Stem cells were inoculated on the cell culture substrate containing two kinds of laminin. Stem cells were then exposed to different cell cultures to induce differentiation. Compared with hepatocytes cultured on different substrates, the obtained hepatocytes have higher metabolic capacity.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】肝细胞的生产方法相关申请的交叉引用本申请要求于2015年10月30日提交的美国临时专利申请序列No.62/248,389的优先权。这些申请的全部内容通过引用并入本文。
技术介绍
干细胞是未分化的细胞，其随后衍生出特化细胞。多能干细胞可以分化成三种胚层(内胚层、中胚层或外胚层)中的任一者。受精后，多能干细胞形成人体内的每种细胞类型，包括可塑性较低的干细胞群，如成体干细胞、胎儿干细胞和羊膜干细胞。胚胎干细胞是一种多能干细胞，并具有广泛的自我更新能力和多能性。最近，通过被称为体细胞重新编程的过程，由哺乳动物的终末分化细胞生成了另一种类型的多能干细胞(诱导多能干细胞)。使干细胞变成更为特化的细胞的过程被称为分化，例如内胚层祖细胞分化成肝细胞。由干细胞衍生的体细胞是用于基础科学和转化科学的大量的细胞来源。虽然颇具前景，但要使这成为现实则需要克服许多障碍。特别是，目前的方案产生功能可变且寿命长的肝细胞，这是在分化过程中使用不明确的成分的结果。和血清的使用是最初的例子，并且仍然是肝细胞分化步骤中批次与批次之间变异性的来源。是从小鼠Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)肉瘤肿瘤组织获得的复杂肿瘤和BM样提取物。主要含有小鼠LN-111、IV型胶原蛋白、基底膜蛋白聚糖和巢蛋白，但也含有不同量的其他物质，包括生长因子和细胞蛋白质，因此其组成不确定，并且各批次间有所不同。最近的研究已经使用小分子来取代生长因子，虽然这极大地降低了工艺成本，但小分子可能会有一些脱靶效应。而且，那些研究使用和血清来驱动分化过程，因此本质上将是可变的。其结果是，难以产生可靠的、可再现的肝细胞培养物。此外，如果要在临床上使用这些细胞，则制造过程必须符合GMP指南。为了遵守这些指南，含有动物性衍生物的产品受到严格控制。因此，希望发展这样的方法，该方法能够在化学成分确定的、不含异源物的、不含病原体的并且批次之间稳定的条件下，使干细胞分化成为已分化细胞，特别是肝细胞。理想的是，这些方法应该提供来自GMP等级人胚胎干细胞(hESC)的大量的这类已分化细胞。
技术实现思路
本文公开了用于生产具有更多自然特性和更多分化功能的肝细胞的方法。通常而言，这些方法包括：在细胞培养基底上接种人多能干细胞，所述细胞培养基底包含(i)第一层粘连蛋白，其为层粘连蛋白-521以及(ii)第二层粘连蛋白，其选自由层粘连蛋白-111和层粘连蛋白-221所构成的组中，其中层粘连蛋白-521和第二层粘连蛋白各自为完整蛋白质或蛋白质片段；以及培养人多能干细胞以得到肝细胞。所得的肝细胞显示出有效的肝细胞特化(specification)、组织、成熟以及细胞功能和稳定性的显著改善。据信，层粘连蛋白抑制不适当的基因调控网络，该基因调控网络控制细胞增殖、干细胞自我更新以及结肠和成纤维细胞特化。干细胞本身应该为研究用等级和GMP等级。层粘连蛋白-521与第二层粘连蛋白的重量比可以为约1:4至约1:1。换言之，与层粘连蛋白-521相比，第二层粘连蛋白更多。可以通过以下步骤进行人多能干细胞的培养：(a)在含有活化素A和Wnt3a的内胚层分化培养基中培养细胞；(b)在成肝细胞分化培养基中培养细胞；(c)然后在含有氢化可的松(HC)、肝细胞生长因子(HGF)和制瘤素m(OSM)的肝细胞成熟培养基中培养细胞。可以将细胞在内胚层分化培养基中培养约60小时至约84小时的一段时间。可以将细胞在成肝细胞分化培养基中培养约73小时至约180小时的一段时间。可以将细胞在肝细胞成熟培养基中培养至少216小时。内胚层分化培养基可以包含RPMI1640和B27。内胚层分化培养基中活化素A的含量可以为约50ng/mL至约150ng/mL。内胚层分化培养基中Wnt3a的含量可以为约20ng/mL至约100ng/mL。成肝细胞分化培养基可以由KO-DMEM、20％的血清替代物、1％的非必需氨基酸、0.1mM的β-巯基乙醇和1％的二甲基亚砜制成。肝细胞成熟培养基中肝细胞生长因子的含量可以为约5ng/mL至约20ng/mL。肝细胞成熟培养基中制瘤素m的含量可以为约10ng/mL至约30ng/mL。或者，可以根据Avior方案或Cameron方案对人多能干细胞进行培养。所得的肝细胞可以显示至少600,000RLU/mg/mL的CYP1A2活性。或者，所得的肝细胞可以显示至少800,000RLU/mg/mL的CYP3A活性。有时，细胞培养基底还包含钙粘蛋白。钙粘蛋白可以为e-钙粘蛋白。(第一层粘连蛋白+第二层粘连蛋白)与钙粘蛋白的重量比可以为约5:1至约15:1。通常，细胞培养基底不含有任何分化抑制剂、饲养细胞、分化诱导物或细胞凋亡抑制剂。以下更具体地公开了本公开的这些和其他非限制性特征。附图简要说明本专利或申请文件包括至少一幅带有颜色的图。在提出请求并支付必要费用后，官方将提供附有彩图的本专利或专利申请公开的副本。下面是附图的简要说明，其目的在于说明本文所公开的示例性实施方案，而不是为了对其进行限制的目的。图1为分化方案的说明，包括代表性视野的相差图像(contrastimage)、各分化阶段存在的细胞类型、所使用的生长因子/分子和培养基以及各阶段的时间线。图2为一组表明在以下三种不同基底上的分化之前和之后的多能干细胞形态的12张显微镜照片：对照培养基(MG)；层粘连蛋白-521(LN521)；以及比例为1:3的层粘连蛋白-521和层粘连蛋白-111的组合(LN111)。图中还示出兔、鼠和羊抗血清的IgG对照染色。图3为一组在图2的三种不同基底上的分化期间的OCT4、Nanog、FOXA2、AFP、HNF4A和ALB表达的六幅柱状图。对于各图，黑色柱为MG；虚线柱为LN521，而白色柱为LN111。y轴为相对表达，并且x轴为天数，四组柱为分化的第0天、第3天、第9天和第18天。用管家基因GAPDH对表达进行归一化。根据通过以Tukey事后检验的单向ANOVA所测量的结果，单星号(*)表示p<0.05，而双星号(**)表示p<0.01。图4为一组生长在三种不同基底上的内胚层细胞和肝细胞的共计15张显微镜照片(放大倍率为10倍至20倍)，图中示出了在分化的第3天，FOXA2、SOX17、甲胎蛋白(AFP)、肝细胞核因子4α(HNF4A)和细胞角蛋白19(CK19)的表达。图中示出了阳性细胞百分比和标准偏差。用hoescht33342对细胞进行复染。图5为一组在分化的第18天、生长在图2的三种不同基底上的肝细胞的白蛋白(ALB)、e-钙粘蛋白(ECAD)和细胞增殖标志物Ki67的表达的九张显微镜照片(放大倍率为10倍)。图中示出了阳性细胞百分比和标准偏差。图6为一组生长在图2的三种不同基底上的肝细胞的CYP2D6和CYP3A4表达的六张显微镜照片(放大倍率为10倍)，以及CYP1A2和CYP3A代谢活性的相应柱状图。图中示出了阳性细胞百分比和标准偏差。在两幅图上，y轴为RLU/mg/mL，而x轴为分化的第16天、第18天、第20天、第22天、第24天和第26天。根据通过以Bonferroni事后检验的单向ANOVA所测量的结果，单星号(*)表示p<0.05，而双星号(**)表示p&a本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产肝细胞的方法，包括：在细胞培养基底上接种人多能干细胞，所述细胞培养基底包含(i)第一层粘连蛋白，其为层粘连蛋白‑521以及(ii)第二层粘连蛋白，其选自由层粘连蛋白‑111和层粘连蛋白‑221所构成的组中，其中所述层粘连蛋白‑521和所述第二层粘连蛋白各自为完整蛋白质或蛋白质片段；和培养所述人多能干细胞以得到肝细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.30 US 62/248,3891.一种生产肝细胞的方法，包括：在细胞培养基底上接种人多能干细胞，所述细胞培养基底包含(i)第一层粘连蛋白，其为层粘连蛋白-521以及(ii)第二层粘连蛋白，其选自由层粘连蛋白-111和层粘连蛋白-221所构成的组中，其中所述层粘连蛋白-521和所述第二层粘连蛋白各自为完整蛋白质或蛋白质片段；和培养所述人多能干细胞以得到肝细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述层粘连蛋白-521与所述第二层粘连蛋白的重量比为约1:4至约1:1。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述人多能干细胞的培养通过以下步骤进行：在含有活化素A和Wnt3a的内胚层分化培养基中培养所述细胞；在成肝细胞分化培养基中培养所述细胞；以及在含有氢化可的松(HC)、肝细胞生长因子(HGF)和制瘤素m(OSM)的肝细胞成熟培养基中培养所述细胞。4.根据权利要求3所述的方法，其中将所述细胞在所述内胚层分化培养基中培养约60小时至约84小时的一段时间。5.根据权利要求3所述的方法，其中将所述细胞在所述成肝细胞分化培养基中培养约73小时至约180小时的一段时间。6.根据权利要求3所述的方法，其中将所述细胞在所述肝细胞成熟培养基中培养至少216小时。7.根据权利要求3所述的方法，其中所述内胚层分化培养基中的所述活化素A的含量为约50ng/mL至约150ng/mL。8.根据权利要求3所述的方法，其中所述内胚层分化培养基中的所述Wnt3...

【专利技术属性】
技术研发人员：路易丝·克里斯蒂娜·哈格巴德，卡尔·贡纳尔·杰斯珀·爱立信，凯瑟琳·雷切尔·卡梅伦，大卫·科林·海伊，斯图尔特·约翰·福布斯，哈桑·拉希迪，
申请(专利权)人：拜奥拉米那公司，爱丁堡大学，
类型：发明
国别省市：瑞典,SE